Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com.Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế.Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer).Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Các vec tơ gen để điều trị bệnh xơ nang phổi phải được nhắm mục tiêu đến đường thở dẫn truyền, vì sự tải nạp phổi ngoại vi không có tác dụng điều trị.Hiệu quả tải nạp virus liên quan trực tiếp đến thời gian cư trú của người mang mầm bệnh.Tuy nhiên, các chất lỏng vận chuyển chẳng hạn như chất mang gen khuếch tán tự nhiên vào phế nang trong quá trình hít vào và các hạt điều trị ở bất kỳ hình dạng nào sẽ nhanh chóng được loại bỏ bằng cách vận chuyển chất nhầy.Kéo dài thời gian cư trú của chất mang gen trong đường hô hấp là quan trọng nhưng khó đạt được.Các hạt từ tính kết hợp với chất mang có thể hướng đến bề mặt của đường hô hấp có thể cải thiện việc nhắm mục tiêu theo khu vực.Do các vấn đề với hình ảnh in vivo, hành vi của các hạt từ tính nhỏ như vậy trên bề mặt đường thở khi có từ trường ứng dụng vẫn chưa được hiểu rõ.Mục đích của nghiên cứu này là sử dụng hình ảnh synchrotron để hình dung in vivo chuyển động của một loạt hạt từ tính trong khí quản của chuột được gây mê nhằm nghiên cứu động lực học và mô hình hành vi của các hạt đơn lẻ và số lượng lớn in vivo.Sau đó, chúng tôi cũng đánh giá xem việc cung cấp các hạt từ tính lentivirus khi có từ trường sẽ làm tăng hiệu quả tải nạp trong khí quản chuột hay không.Hình ảnh X-quang synchrotron cho thấy hành vi của các hạt từ tính trong từ trường đứng yên và chuyển động trong ống nghiệm và trong cơ thể sống.Các hạt không thể dễ dàng bị kéo qua bề mặt của đường thở bằng nam châm, nhưng trong quá trình vận chuyển, các hạt sẽ tập trung trong trường nhìn, nơi từ trường mạnh nhất.Hiệu suất tải nạp cũng tăng gấp sáu lần khi các hạt từ tính lentivirus được phân phối khi có từ trường.Kết hợp lại với nhau, những kết quả này cho thấy rằng các hạt từ tính lentivirus và từ trường có thể là những cách tiếp cận có giá trị để cải thiện mức độ tải nạp và nhắm mục tiêu của vec tơ gen trong đường dẫn khí in vivo.
Xơ nang (CF) được gây ra bởi các biến thể trong một gen duy nhất được gọi là bộ điều chỉnh độ dẫn xuyên màng CF (CFTR).Protein CFTR là một kênh ion hiện diện trong nhiều tế bào biểu mô trên khắp cơ thể, bao gồm cả đường thở, một vị trí chính trong cơ chế bệnh sinh của bệnh xơ nang.Khiếm khuyết trong CFTR dẫn đến vận chuyển nước bất thường, mất nước bề mặt đường thở và giảm độ sâu lớp chất lỏng bề mặt đường thở (ASL).Nó cũng làm suy yếu khả năng của hệ thống vận chuyển chất nhầy (MCT) để làm sạch đường hô hấp của các hạt và mầm bệnh hít vào.Mục tiêu của chúng tôi là phát triển liệu pháp gen lentivirus (LV) để cung cấp bản sao chính xác của gen CFTR và cải thiện ASL, MCT và sức khỏe của phổi, đồng thời tiếp tục phát triển các công nghệ mới có thể đo các thông số này trong vivo1.
Các vectơ LV là một trong những ứng cử viên hàng đầu cho liệu pháp gen xơ nang, chủ yếu là do chúng có thể tích hợp vĩnh viễn gen điều trị vào các tế bào đáy đường thở (tế bào gốc đường thở).Điều này rất quan trọng vì chúng có thể khôi phục quá trình hydrat hóa bình thường và thanh thải chất nhầy bằng cách biệt hóa thành các tế bào bề mặt đường thở được điều chỉnh gen chức năng liên quan đến bệnh xơ nang, mang lại lợi ích lâu dài.Các vec-tơ LV phải hướng vào các đường dẫn khí, vì đây là nơi bắt đầu có sự tham gia của phổi trong CF.Đưa véc tơ vào sâu hơn trong phổi có thể dẫn đến sự tải nạp phế nang, nhưng điều này không có tác dụng điều trị bệnh xơ nang.Tuy nhiên, các chất lỏng như chất mang gen di chuyển tự nhiên vào phế nang khi được hít vào sau khi sinh3,4 và các hạt điều trị nhanh chóng bị MCT đẩy vào khoang miệng.Hiệu quả của tải nạp LV có liên quan trực tiếp đến khoảng thời gian vectơ ở gần các tế bào đích để cho phép tế bào hấp thu – “thời gian cư trú” 5 dễ dàng được rút ngắn bởi luồng không khí khu vực điển hình cũng như sự hấp thu phối hợp của chất nhầy và các hạt MCT.Đối với bệnh xơ nang, khả năng kéo dài thời gian lưu trú của LV trong đường thở là rất quan trọng để đạt được mức độ tải nạp cao ở khu vực này, nhưng cho đến nay vẫn còn nhiều thách thức.
Để vượt qua rào cản này, chúng tôi đề xuất rằng các hạt từ tính LV (MP) có thể hỗ trợ theo hai cách bổ sung.Đầu tiên, chúng có thể được nam châm dẫn hướng đến bề mặt đường thở để cải thiện việc nhắm mục tiêu và giúp các hạt mang gen ở đúng khu vực của đường thở;và ASL) di chuyển vào lớp tế bào 6. MP được sử dụng rộng rãi làm phương tiện vận chuyển thuốc nhắm mục tiêu khi chúng liên kết với kháng thể, thuốc hóa trị hoặc các phân tử nhỏ khác gắn vào màng tế bào hoặc liên kết với các thụ thể bề mặt tế bào tương ứng của chúng và tích tụ tại các vị trí khối u trong sự hiện diện của tĩnh điện.Từ trường trong điều trị ung thư 7. Các phương pháp “siêu nhiệt” khác nhằm mục đích tiêu diệt các tế bào khối u bằng cách làm nóng MP khi tiếp xúc với từ trường dao động.Nguyên tắc truyền từ tính, trong đó từ trường được sử dụng như một tác nhân truyền để tăng cường chuyển DNA vào tế bào, thường được sử dụng trong ống nghiệm bằng cách sử dụng một loạt các vec tơ gen không phải virus và virus cho các dòng tế bào khó tải nạp ..Hiệu quả của chuyển đổi từ trường LV với việc cung cấp LV MP trong ống nghiệm vào dòng tế bào biểu mô phế quản của con người với sự có mặt của từ trường tĩnh đã được thiết lập, tăng hiệu quả tải nạp lên 186 lần so với chỉ riêng vec tơ LV.LV MT cũng đã được áp dụng cho mô hình xơ nang in vitro, trong đó sự truyền từ tính làm tăng tải nạp LV trong môi trường nuôi cấy giao diện không khí-lỏng theo hệ số 20 khi có đờm xơ nang10.Tuy nhiên, sự truyền nhiễm từ cơ quan in vivo đã nhận được tương đối ít sự chú ý và chỉ được đánh giá trong một số nghiên cứu trên động vật11,12,13,14,15, đặc biệt là ở phổi16,17.Tuy nhiên, khả năng truyền từ tính trong điều trị phổi ở bệnh xơ nang là rõ ràng.Tân và cộng sự.(2020) tuyên bố rằng “một nghiên cứu xác nhận về việc cung cấp hiệu quả phổi của các hạt nano từ tính sẽ mở đường cho các chiến lược hít CFTR trong tương lai để cải thiện kết quả lâm sàng ở bệnh nhân bị xơ nang”6.
Hành vi của các hạt từ tính nhỏ trên bề mặt đường hô hấp khi có từ trường ứng dụng rất khó hình dung và nghiên cứu, do đó chúng chưa được hiểu rõ.Trong các nghiên cứu khác, chúng tôi đã phát triển phương pháp Chụp X-quang Tương phản Pha (PB-PCXI) dựa trên Tuyên truyền Synchrotron để tạo ảnh không xâm lấn và định lượng các thay đổi nhỏ in vivo về độ sâu ASL18 và hành vi MCT19,20 để đo trực tiếp quá trình hydrat hóa bề mặt kênh khí và được sử dụng như một chỉ báo sớm về hiệu quả điều trị.Ngoài ra, phương pháp tính điểm MCT của chúng tôi sử dụng các hạt có đường kính 10–35 µm bao gồm nhôm oxit hoặc thủy tinh có chỉ số khúc xạ cao làm chất đánh dấu MCT có thể nhìn thấy bằng PB-PCXI21.Cả hai phương pháp đều phù hợp để chụp ảnh nhiều loại hạt, bao gồm cả MP.
Do độ phân giải không gian và thời gian cao, các thử nghiệm ASL và MCT dựa trên PB-PCXI của chúng tôi rất phù hợp để nghiên cứu động lực học và mô hình hành vi của các hạt đơn lẻ và số lượng lớn in vivo để giúp chúng tôi hiểu và tối ưu hóa các phương pháp phân phối gen MP.Phương pháp chúng tôi sử dụng ở đây dựa trên các nghiên cứu của chúng tôi bằng cách sử dụng chùm tia SPring-8 BL20B2, trong đó chúng tôi hình dung chuyển động của chất lỏng sau khi đưa một liều vec tơ giả vào đường hô hấp ở mũi và phổi của chuột để giúp giải thích các kiểu biểu hiện gen không đồng nhất của chúng tôi đã quan sát được trong gen của chúng ta.nghiên cứu trên động vật với liều mang là 3,4 .
Mục đích của nghiên cứu này là sử dụng synchrotron PB-PCXI để hình dung chuyển động in vivo của một loạt MP trong khí quản của chuột sống.Các nghiên cứu hình ảnh PB-PCXI này được thiết kế để kiểm tra chuỗi MP, cường độ từ trường và vị trí nhằm xác định ảnh hưởng của chúng đối với chuyển động của MP.Chúng tôi giả định rằng một từ trường bên ngoài sẽ giúp MF được giao ở lại hoặc di chuyển đến khu vực mục tiêu.Những nghiên cứu này cũng cho phép chúng tôi xác định cấu hình nam châm tối đa hóa lượng hạt còn lại trong khí quản sau khi lắng đọng.Trong loạt nghiên cứu thứ hai, chúng tôi nhằm mục đích sử dụng cấu hình tối ưu này để chứng minh mô hình tải nạp do phân phối LV-MP in vivo đến đường thở của chuột, với giả định rằng việc phân phối LV-MP trong bối cảnh nhắm mục tiêu đường thở sẽ dẫn đến kết quả tăng hiệu suất tải nạp LV..
Tất cả các nghiên cứu trên động vật được thực hiện theo các giao thức đã được Đại học Adelaide (M-2019-060 và M-2020-022) và Ủy ban Đạo đức Động vật Synchrotron SPring-8 phê duyệt.Các thí nghiệm được thực hiện theo các khuyến nghị của ARRIVE.
Tất cả các hình ảnh tia X được chụp tại chùm tia BL20XU tại synchrotron SPring-8 ở Nhật Bản bằng cách sử dụng một thiết lập tương tự như mô tả trước đây21,22.Tóm lại, hộp thử nghiệm được đặt cách vòng lưu trữ synchrotron 245 m.Khoảng cách từ mẫu đến máy dò là 0,6 m được sử dụng cho nghiên cứu hình ảnh hạt và 0,3 m cho nghiên cứu hình ảnh in vivo để tạo hiệu ứng tương phản pha.Một chùm tia đơn sắc có năng lượng 25 keV đã được sử dụng.Các hình ảnh được thu được bằng đầu dò tia X có độ phân giải cao (SPring-8 BM3) được ghép nối với máy dò sCMOS.Đầu dò chuyển đổi tia X thành ánh sáng khả kiến ​​bằng cách sử dụng chất nhấp nháy dày 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), sau đó được hướng tới cảm biến sCMOS bằng vật kính kính hiển vi ×10 (NA 0,3).Máy dò sCMOS là Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Nhật Bản) với kích thước mảng là 2048 × 2048 pixel và kích thước pixel thô là 6,5 × 6,5 µm.Cài đặt này cung cấp kích thước pixel đẳng hướng hiệu quả là 0,51 µm và trường nhìn khoảng 1,1 mm × 1,1 mm.Thời lượng phơi nhiễm 100 ms được chọn để tối đa hóa tỷ lệ tín hiệu trên tạp âm của các hạt từ tính bên trong và bên ngoài đường thở đồng thời giảm thiểu các tạo tác chuyển động do hơi thở gây ra.Đối với các nghiên cứu in vivo, một màn trập tia X nhanh được đặt trong đường truyền tia X để hạn chế liều bức xạ bằng cách chặn chùm tia X giữa các lần phơi nhiễm.
Phương tiện LV không được sử dụng trong bất kỳ nghiên cứu tạo ảnh PB-PCXI SPring-8 nào vì buồng tạo ảnh BL20XU không được chứng nhận An toàn sinh học Cấp 2.Thay vào đó, chúng tôi đã chọn một loạt các MP có đặc tính tốt từ hai nhà cung cấp thương mại bao gồm nhiều kích cỡ, vật liệu, nồng độ sắt và ứng dụng — trước tiên là để hiểu cách từ trường ảnh hưởng đến chuyển động của MP trong các mao quản thủy tinh, sau đó là đường thở sống.mặt.Kích thước của MP thay đổi từ 0,25 đến 18 µm và được làm từ nhiều vật liệu khác nhau (xem Bảng 1), nhưng thành phần của từng mẫu, bao gồm kích thước của các hạt từ tính trong MP, vẫn chưa được biết.Dựa trên các nghiên cứu MCT mở rộng của chúng tôi 19, 20, 21, 23, 24, chúng tôi hy vọng rằng các MP có kích thước nhỏ tới 5 µm có thể được nhìn thấy trên bề mặt khí quản, chẳng hạn như bằng cách trừ các khung hình liên tiếp để thấy khả năng hiển thị chuyển động của MP được cải thiện.Một MP đơn lẻ 0,25 µm nhỏ hơn độ phân giải của thiết bị hình ảnh, nhưng PB-PCXI dự kiến ​​sẽ phát hiện độ tương phản thể tích của chúng và chuyển động của chất lỏng bề mặt mà chúng được lắng đọng sau khi được lắng đọng.
Các mẫu cho mỗi MP trong bảng.1 được điều chế trong các mao quản thủy tinh 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) với đường kính trong là 0,63 mm.Các hạt tiểu thể có sẵn trong nước, trong khi các hạt CombiMag có sẵn trong chất lỏng độc quyền của nhà sản xuất.Mỗi ống được đổ đầy một nửa chất lỏng (khoảng 11 µl) và đặt trên giá đỡ mẫu (xem Hình 1).Các mao quản thủy tinh lần lượt được đặt nằm ngang trên bệ trong buồng tạo ảnh và được đặt ở các cạnh của chất lỏng.Một nam châm vỏ niken có đường kính 19 mm (dài 28 mm) làm bằng đất hiếm, neodymium, sắt và bo (NdFeB) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) với từ dư 1,17 T được gắn vào một nam châm bảng chuyển riêng biệt để đạt được Thay đổi vị trí của bạn từ xa trong quá trình kết xuất.Quá trình tạo ảnh tia X bắt đầu khi nam châm được đặt cách mẫu khoảng 30 mm và hình ảnh được thu ở 4 khung hình mỗi giây.Trong quá trình chụp ảnh, nam châm được đưa lại gần ống mao dẫn thủy tinh (ở khoảng cách khoảng 1 mm) rồi di chuyển dọc theo ống để đánh giá ảnh hưởng của cường độ trường và vị trí.
Một thiết lập hình ảnh trong ống nghiệm có chứa các mẫu MP trong mao quản thủy tinh ở giai đoạn dịch mẫu xy.Đường đi của chùm tia X được đánh dấu bằng một đường chấm chấm màu đỏ.
Sau khi khả năng hiển thị trong ống nghiệm của MP được thiết lập, một tập hợp con của chúng đã được thử nghiệm in vivo trên chuột bạch tạng Wistar cái kiểu hoang dã (~ 12 tuần tuổi, ~ 200 g).Medetomidine 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Nhật Bản), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Nhật Bản) và butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Chuột được gây mê bằng hỗn hợp Pharma (Nhật Bản) bằng cách tiêm màng bụng.Sau khi gây mê, họ đã được chuẩn bị để chụp ảnh bằng cách loại bỏ lông xung quanh khí quản, đặt ống nội khí quản (ET; 16 Ga ống thông tĩnh mạch, Terumo BCT) và cố định họ ở tư thế nằm ngửa trên một tấm chụp ảnh tùy chỉnh có chứa túi nhiệt. để duy trì nhiệt độ cơ thể.22. Sau đó, tấm tạo ảnh được gắn vào bệ mẫu trong hộp tạo ảnh ở một góc nhỏ để căn chỉnh khí quản theo chiều ngang trên hình ảnh X-quang như trong Hình 2a.
( a ) Thiết lập hình ảnh in vivo trong thiết bị hình ảnh SPring-8, đường tia X được đánh dấu bằng đường chấm màu đỏ.( b, c ) Định vị nam châm khí quản được thực hiện từ xa bằng hai camera IP được gắn trực giao.Ở phía bên trái của hình ảnh trên màn hình, bạn có thể thấy vòng dây giữ đầu và ống dẫn truyền được lắp bên trong ống ET.
Hệ thống bơm ống tiêm được điều khiển từ xa (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) sử dụng ống tiêm thủy tinh 100 µl được kết nối với ống PE10 (đường kính ngoài 0,61 mm, đường kính trong 0,28 mm) bằng kim 30 Ga.Đánh dấu đầu ống để đảm bảo rằng đầu ống nằm đúng vị trí trong khí quản khi đưa ống nội khí quản.Sử dụng một máy bơm siêu nhỏ, pít-tông của ống tiêm được tháo ra và đầu ống được ngâm trong mẫu MP sẽ được chuyển đến.Sau đó, ống phân phối đã nạp được đưa vào ống nội khí quản, đặt đầu ở phần mạnh nhất của từ trường được áp dụng dự kiến ​​của chúng tôi.Việc thu thập hình ảnh được kiểm soát bằng máy dò hơi thở được kết nối với hộp thời gian dựa trên Arduino của chúng tôi và tất cả các tín hiệu (ví dụ: nhiệt độ, hô hấp, mở/đóng màn trập và thu nhận hình ảnh) được ghi lại bằng Powerlab và LabChart (Công cụ AD, Sydney, Úc) 22 Khi tạo ảnh Khi không có hộp chứa, hai camera IP (Panasonic BB-SC382) được đặt ở vị trí xấp xỉ 90° với nhau và được sử dụng để điều khiển vị trí của nam châm so với khí quản trong quá trình tạo ảnh (Hình 2b, c).Để giảm thiểu các tạo tác chuyển động, một hình ảnh cho mỗi hơi thở đã được thu nhận trong trạng thái ổn định của dòng hô hấp cuối cùng.
Nam châm được gắn vào giai đoạn thứ hai, có thể được đặt từ xa ở bên ngoài thân máy tạo ảnh.Các vị trí và cấu hình khác nhau của nam châm đã được thử nghiệm, bao gồm: đặt ở một góc khoảng 30° so với khí quản (cấu hình được thể hiện trong Hình 2a và 3a);một nam châm phía trên con vật và một nam châm phía dưới, với các cực được đặt để hút (Hình 3b)., một nam châm phía trên con vật và một phía dưới, với các cực được đặt để tạo lực đẩy (Hình 3c), và một nam châm phía trên và vuông góc với khí quản (Hình 3d).Sau khi thiết lập động vật và nam châm, đồng thời nạp MP được thử nghiệm vào bơm tiêm, cung cấp một liều lượng 50 µl với tốc độ 4 µl/giây khi thu được hình ảnh.Sau đó, nam châm được di chuyển qua lại dọc theo hoặc ngang qua khí quản trong khi tiếp tục thu được hình ảnh.
Cấu hình nam châm để chụp ảnh in vivo (a) một nam châm phía trên khí quản ở một góc xấp xỉ 30°, (b) hai nam châm được cấu hình để hút, (c) hai nam châm được cấu hình để đẩy, (d) một nam châm ở trên và vuông góc với khí quản khí quản.Người quan sát nhìn xuống từ miệng đến phổi qua khí quản và chùm tia X đi qua bên trái của con chuột và thoát ra bên phải.Nam châm được di chuyển dọc theo chiều dài của đường thở hoặc sang trái và phải phía trên khí quản theo hướng của chùm tia X.
Chúng tôi cũng tìm cách xác định khả năng hiển thị và hành vi của các hạt trong đường thở trong trường hợp không có sự pha trộn giữa hô hấp và nhịp tim.Do đó, vào cuối giai đoạn chụp ảnh, động vật đã được tiêu hủy một cách nhân đạo do dùng quá liều pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip).Một số động vật được để lại trên nền hình ảnh và sau khi ngừng thở và ngừng tim, quá trình hình ảnh được lặp lại, thêm một liều MP bổ sung nếu không nhìn thấy MP trên bề mặt đường thở.
Các hình ảnh thu được đã được chỉnh sửa cho trường phẳng và tối, sau đó được ghép thành phim (20 khung hình mỗi giây; 15–25 × tốc độ bình thường tùy thuộc vào nhịp thở) bằng tập lệnh tùy chỉnh được viết trong MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Tất cả các nghiên cứu về chuyển giao véc tơ gen LV đã được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu động vật trong phòng thí nghiệm của Đại học Adelaide và nhằm mục đích sử dụng kết quả của thí nghiệm SPring-8 để đánh giá xem việc chuyển giao LV-MP khi có từ trường có thể tăng cường chuyển gen trong cơ thể hay không .Để đánh giá tác động của MF và từ trường, hai nhóm động vật đã được xử lý: một nhóm được tiêm LV MF có đặt nam châm và nhóm còn lại được tiêm LV MF không có nam châm vào nhóm đối chứng.
Các vectơ gen LV đã được tạo bằng các phương pháp được mô tả trước đó 25, 26 .Vectơ LacZ biểu hiện gen beta-galactosidase cục bộ trong nhân được điều khiển bởi chất kích thích cấu thành MPSV (LV-LacZ), gen này tạo ra sản phẩm phản ứng màu xanh lam trong các tế bào được tải nạp, có thể nhìn thấy trên mặt trước và các phần của mô phổi.Quá trình chuẩn độ được thực hiện trong nuôi cấy tế bào bằng cách đếm thủ công số lượng tế bào dương tính với LacZ bằng cách sử dụng máy đo huyết sắc tố để tính hiệu giá tính bằng TU/ml.Chất mang được bảo quản lạnh ở -80°C, rã đông trước khi sử dụng và liên kết với CombiMag bằng cách trộn theo tỷ lệ 1:1 và ủ trên đá ít nhất 30 phút trước khi giao hàng.
Chuột Sprague Dawley bình thường (n = 3/nhóm, ~2-3 con chuột được gây mê bằng hỗn hợp medetomidine 0,4 mg/kg (Domitor, Ilium, Australia) và 60 mg/kg ketamine (Ilium, Australia) lúc 1 tháng tuổi) ip ) tiêm và đặt ống thông miệng không phẫu thuật bằng ống thông tĩnh mạch 16 Ga.Để đảm bảo rằng mô khí quản nhận được sự tải nạp LV, nó đã được điều hòa bằng cách sử dụng giao thức nhiễu loạn cơ học được mô tả trước đây của chúng tôi, trong đó bề mặt khí quản được cọ xát dọc trục bằng một giỏ dây (N-Circle, máy chiết xuất đá nitinol không có đầu NTSE-022115) -UDH , Cook Medical, Mỹ) 30 p28.Sau đó, khoảng 10 phút sau khi xáo trộn trong tủ an toàn sinh học, việc sử dụng LV-MP trong khí quản đã được thực hiện.
Từ trường được sử dụng trong thí nghiệm này được cấu hình tương tự như nghiên cứu chụp X-quang in vivo, với cùng nam châm được giữ trên khí quản bằng kẹp stent chưng cất (Hình 4).Một thể tích 50 μl (2 x 25 μl aliquots) của LV-MP đã được chuyển đến khí quản (n = 3 động vật) bằng cách sử dụng pipet có đầu gel như đã mô tả trước đây.Nhóm kiểm soát (n = 3 động vật) đã nhận được LV-MP tương tự mà không cần sử dụng nam châm.Sau khi truyền xong, ống thông được lấy ra khỏi ống nội khí quản và con vật được rút nội khí quản.Nam châm vẫn ở nguyên vị trí trong 10 phút trước khi được gỡ bỏ.Chuột được tiêm dưới da meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Úc) sau đó ngừng gây mê bằng cách tiêm trong màng bụng 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Úc).Chuột được giữ ấm và theo dõi cho đến khi hồi phục hoàn toàn sau khi gây mê.
Thiết bị phân phối LV-MP trong tủ an toàn sinh học.Bạn có thể thấy rằng ống Luer-lock màu xám nhạt của ống ET nhô ra khỏi miệng và đầu pipet gel như trong hình được đưa qua ống ET đến độ sâu mong muốn vào khí quản.
Một tuần sau quy trình quản lý LV-MP, động vật đã bị hy sinh một cách nhân đạo bằng cách hít phải 100% CO2 và biểu hiện LacZ được đánh giá bằng cách sử dụng phương pháp xử lý X-gal tiêu chuẩn của chúng tôi.Ba vòng sụn đuôi nhất đã được loại bỏ để đảm bảo rằng bất kỳ tổn thương cơ học hoặc ứ dịch nào do đặt ống nội khí quản sẽ không được đưa vào phân tích.Mỗi khí quản được cắt theo chiều dọc để thu được hai nửa để phân tích và đặt vào cốc chứa cao su silicon (Sylgard, Dow Inc) bằng kim Minutien (Công cụ khoa học tốt) để hình dung bề mặt bên trong.Sự phân bố và đặc tính của các tế bào được tải nạp đã được xác nhận bằng cách chụp ảnh phía trước bằng kính hiển vi Nikon (SMZ1500) với máy ảnh DigiLite và phần mềm TCapture (Tucsen Photonics, Trung Quốc).Hình ảnh thu được ở độ phóng đại 20 lần (bao gồm cài đặt tối đa cho toàn bộ chiều rộng của khí quản), với toàn bộ chiều dài của khí quản được hiển thị từng bước, cung cấp đủ độ chồng chéo giữa mỗi hình ảnh để cho phép hình ảnh được “khâu”.Hình ảnh từ mỗi khí quản sau đó được kết hợp thành một hình ảnh tổng hợp duy nhất bằng Trình chỉnh sửa hình ảnh tổng hợp phiên bản 2.0.3 (Nghiên cứu của Microsoft) bằng thuật toán chuyển động phẳng. Vùng biểu hiện LacZ trong các hình ảnh tổng hợp khí quản từ mỗi con vật được định lượng bằng cách sử dụng tập lệnh MATLAB tự động (R2020a, MathWorks) như đã mô tả trước đây28, sử dụng các cài đặt 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 và Value < 0,7. Khu vực biểu hiện LacZ trong các hình ảnh tổng hợp khí quản từ mỗi con vật được định lượng bằng cách sử dụng tập lệnh MATLAB tự động (R2020a, MathWorks) như đã mô tả trước đây28, sử dụng các cài đặt 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 và Value < 0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Khu vực biểu hiện LacZ trong hình ảnh khí quản tổng hợp từ mỗi động vật được định lượng bằng cách sử dụng tập lệnh MATLAB tự động (R2020a, MathWorks) như đã mô tả trước đây28 bằng cách sử dụng cài đặt 0,350.15 và giá trị<0 .7.如 ， ， 使用 matlab 脚本 R2020A ， Mathworks） 来自 只 动物 的 气管 复合 中 的 的 lacz如 前所 ， 自动 matlab 脚本 （（（， ，） 每 的 气管 复合 图像 的 的 的 表达 表达 ， .................... HÔNG Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Các vùng biểu hiện LacZ trên hình ảnh tổng hợp của khí quản của từng con vật được định lượng bằng cách sử dụng tập lệnh MATLAB tự động (R2020a, MathWorks) như được mô tả trước đây bằng cách sử dụng cài đặt 0,35 < hue < 0,58, độ bão hòa > 0,15 và giá trị < 0,7 .Bằng cách theo dõi các đường viền của mô trong GIMP v2.10.24, một mặt nạ được tạo theo cách thủ công cho mỗi hình ảnh tổng hợp để xác định vùng mô và ngăn mọi phát hiện sai bên ngoài mô khí quản.Các khu vực nhuộm màu từ tất cả các hình ảnh tổng hợp từ mỗi con vật được cộng lại để đưa ra tổng diện tích nhuộm màu cho con vật đó.Khu vực được sơn sau đó được chia cho tổng diện tích của mặt nạ để có được khu vực chuẩn hóa.
Mỗi khí quản được nhúng trong parafin và cắt thành từng phần dày 5 µm.Các phần được nhuộm tương phản với màu đỏ nhanh trung tính trong 5 phút và hình ảnh được thu được bằng kính hiển vi Nikon Eclipse E400, máy ảnh DS-Fi3 và phần mềm chụp phần tử NIS (phiên bản 5.20.00).
Tất cả các phân tích thống kê đã được thực hiện trong GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Ý nghĩa thống kê được đặt ở p ≤ 0,05.Tính quy phạm đã được kiểm tra bằng thử nghiệm Shapiro-Wilk và sự khác biệt trong nhuộm LacZ được đánh giá bằng thử nghiệm t không ghép đôi.
Sáu MP được mô tả trong Bảng 1 đã được PCXI kiểm tra và khả năng hiển thị được mô tả trong Bảng 2. Hai MP polystyrene (MP1 và MP2; tương ứng là 18 µm và 0,25 µm) không được PCXI nhìn thấy, nhưng các mẫu còn lại có thể được xác định (các ví dụ được thể hiện trong Hình 5).MP3 và MP4 có thể nhìn thấy yếu (10-15% Fe3O4; 0,25 µm và 0,9 µm, tương ứng).Mặc dù MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) chứa một số hạt nhỏ nhất được thử nghiệm, nhưng nó lại rõ ràng nhất.Sản phẩm CombiMag MP6 rất khó phân biệt.Trong mọi trường hợp, khả năng phát hiện MF của chúng tôi đã được cải thiện rất nhiều bằng cách di chuyển nam châm qua lại song song với mao quản.Khi nam châm di chuyển ra khỏi mao quản, các hạt bị kéo ra thành chuỗi dài, nhưng khi nam châm đến gần và cường độ từ trường tăng lên, chuỗi hạt ngắn lại khi các hạt di chuyển về phía bề mặt trên của mao quản (xem Video bổ sung S1 : MP4), tăng mật độ hạt ở bề mặt.Ngược lại, khi nam châm được lấy ra khỏi mao quản, cường độ trường giảm và các MP sắp xếp lại thành chuỗi dài kéo dài từ bề mặt trên của mao quản (xem Video bổ sung S2: MP4).Sau khi nam châm ngừng chuyển động, các hạt tiếp tục chuyển động một thời gian sau khi đạt đến vị trí cân bằng.Khi MP di chuyển tới và ra khỏi bề mặt trên của mao quản, các hạt từ tính có xu hướng hút các mảnh vụn qua chất lỏng.
Khả năng hiển thị của MP dưới PCXI thay đổi đáng kể giữa các mẫu.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 và (d) MP6.Tất cả các hình ảnh hiển thị ở đây được chụp bằng một nam châm được định vị ngay phía trên mao quản khoảng 10 mm.Các vòng tròn lớn rõ ràng là các bong bóng khí bị mắc kẹt trong các mao mạch, hiển thị rõ ràng các đặc điểm viền đen và trắng của hình ảnh tương phản pha.Hộp màu đỏ cho biết độ phóng đại giúp tăng cường độ tương phản.Lưu ý rằng đường kính của các mạch nam châm trong tất cả các hình không theo tỷ lệ và lớn hơn khoảng 100 lần so với hình minh họa.
Khi nam châm di chuyển sang trái và phải dọc theo đỉnh của mao dẫn, góc của chuỗi MP thay đổi để thẳng hàng với nam châm (xem Hình 6), do đó phân định các đường sức từ.Đối với MP3-5, sau khi hợp âm đạt đến góc ngưỡng, các hạt kéo dọc theo bề mặt trên của mao quản.Điều này thường dẫn đến việc các MP tập hợp thành các nhóm lớn hơn gần nơi có từ trường mạnh nhất (xem Video bổ sung S3: MP5).Điều này cũng đặc biệt rõ ràng khi chụp ảnh gần cuối mao quản, khiến MP kết tụ và tập trung ở giao diện chất lỏng-không khí.Các hạt trong MP6, khó phân biệt hơn so với các hạt trong MP3-5, không bị kéo khi nam châm di chuyển dọc theo mao quản, nhưng các chuỗi MP tách ra, để lại các hạt trong tầm nhìn (xem Video bổ sung S4: MP6).Trong một số trường hợp, khi từ trường ứng dụng bị giảm bằng cách di chuyển nam châm ra xa vị trí chụp ảnh, bất kỳ MP nào còn lại từ từ rơi xuống bề mặt dưới cùng của ống do trọng lực, còn lại trong chuỗi (xem Video bổ sung S5: MP3) .
Góc của chuỗi MP thay đổi khi nam châm di chuyển sang bên phải phía trên ống mao dẫn.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 và (d) MP6.Hộp màu đỏ cho biết độ phóng đại giúp tăng cường độ tương phản.Xin lưu ý rằng các video bổ sung nhằm mục đích cung cấp thông tin vì chúng tiết lộ cấu trúc hạt quan trọng và thông tin động không thể hiển thị được trong các hình ảnh tĩnh này.
Các thử nghiệm của chúng tôi đã chỉ ra rằng việc di chuyển nam châm qua lại từ từ dọc theo khí quản sẽ tạo điều kiện cho việc hình dung MF trong bối cảnh chuyển động phức tạp trong cơ thể.Không có thử nghiệm in vivo nào được thực hiện vì không nhìn thấy các hạt polystyrene (MP1 và MP2) trong mao quản.Mỗi trong số bốn MF còn lại đã được thử nghiệm in vivo với trục dài của nam châm được định vị trên khí quản ở một góc khoảng 30° so với phương thẳng đứng (xem Hình 2b và 3a), vì điều này dẫn đến chuỗi MF dài hơn và hiệu quả hơn hơn nam châm..cấu hình chấm dứt.MP3, MP4 và MP6 chưa được tìm thấy trong khí quản của bất kỳ động vật sống nào.Khi hình dung đường hô hấp của chuột sau khi giết chết động vật một cách nhân đạo, các hạt vẫn vô hình ngay cả khi thêm thể tích bổ sung bằng bơm tiêm.MP5 có hàm lượng oxit sắt cao nhất và là hạt duy nhất có thể nhìn thấy, vì vậy nó được sử dụng để đánh giá và mô tả hành vi của MP trong cơ thể.
Vị trí của nam châm trên khí quản trong quá trình chèn MF dẫn đến nhiều, nhưng không phải tất cả, MF được tập trung trong trường nhìn.Sự xâm nhập của các hạt vào khí quản được quan sát rõ nhất ở những động vật đã chết nhân đạo.Hình 7 và Video bổ sung S6: MP5 cho thấy sự bắt giữ từ tính nhanh chóng và sự liên kết của các hạt trên bề mặt của khí quản bụng, cho thấy rằng các MP có thể được nhắm mục tiêu đến các khu vực mong muốn của khí quản.Khi tìm kiếm xa hơn dọc theo khí quản sau khi truyền MF, một số MF được tìm thấy gần carina hơn, điều này cho thấy cường độ từ trường không đủ để thu thập và giữ tất cả các MF, vì chúng được chuyển qua vùng có cường độ từ trường tối đa trong quá trình quản lý chất lỏng.quá trình.Tuy nhiên, nồng độ MP sau sinh cao hơn xung quanh khu vực hình ảnh, cho thấy rằng nhiều MP vẫn ở trong vùng đường thở nơi cường độ từ trường được áp dụng là cao nhất.
Hình ảnh (a) trước và (b) sau khi truyền MP5 vào khí quản của một con chuột mới được cho chết bằng nam châm được đặt ngay phía trên khu vực hình ảnh.Khu vực được mô tả nằm giữa hai vòng sụn.Có một số chất lỏng trong đường thở trước khi MP được cung cấp.Hộp màu đỏ cho biết độ phóng đại giúp tăng cường độ tương phản.Những hình ảnh này được lấy từ video có trong S6: Video bổ sung MP5.
Di chuyển nam châm dọc theo khí quản in vivo dẫn đến thay đổi góc của chuỗi MP trên bề mặt đường thở, tương tự như góc được quan sát thấy trong các mao mạch (xem Hình 8 và Video bổ sung S7: MP5).Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi, các MP không thể bị kéo dọc theo bề mặt của đường hô hấp sống, như các mao mạch có thể làm được.Trong một số trường hợp, chuỗi MP dài ra khi nam châm di chuyển sang trái và phải.Thật thú vị, chúng tôi cũng phát hiện ra rằng chuỗi hạt thay đổi độ sâu của lớp bề mặt của chất lỏng khi nam châm được di chuyển dọc theo khí quản và mở rộng khi nam châm được di chuyển trực tiếp trên đầu và chuỗi hạt được xoay sang vị trí thẳng đứng (xem Video bổ sung S7).: MP5 lúc 0:09, dưới cùng bên phải).Mô hình chuyển động đặc trưng đã thay đổi khi nam châm được di chuyển ngang qua đỉnh khí quản (nghĩa là sang trái hoặc phải của con vật, thay vì dọc theo chiều dài của khí quản).Các hạt vẫn có thể nhìn thấy rõ ràng trong quá trình di chuyển của chúng, nhưng khi nam châm được lấy ra khỏi khí quản, các đầu của chuỗi hạt có thể nhìn thấy được (xem Video bổ sung S8: MP5, bắt đầu từ 0:08).Điều này phù hợp với hành vi quan sát được của từ trường dưới tác dụng của từ trường ứng dụng trong mao quản thủy tinh.
Hình ảnh mẫu cho thấy MP5 trong khí quản của một con chuột sống được gây mê.(a) Nam châm được sử dụng để thu được hình ảnh phía trên và bên trái của khí quản, sau đó (b) sau khi di chuyển nam châm sang bên phải.Hộp màu đỏ cho biết độ phóng đại giúp tăng cường độ tương phản.Những hình ảnh này là từ video có trong Video bổ sung của S7: MP5.
Khi hai cực được điều chỉnh theo hướng bắc-nam bên trên và bên dưới khí quản (nghĩa là thu hút; Hình 3b), các hợp âm MP xuất hiện dài hơn và nằm trên thành bên của khí quản thay vì trên mặt lưng của khí quản. khí quản (xem Phụ lục).Video S9:MP5).Tuy nhiên, nồng độ cao của các hạt tại một vị trí (tức là mặt lưng của khí quản) không được phát hiện sau khi truyền dịch bằng thiết bị nam châm kép, thường xảy ra với một thiết bị nam châm.Sau đó, khi một nam châm được định cấu hình để đẩy các cực đối diện (Hình 3c), số lượng hạt có thể nhìn thấy trong trường nhìn không tăng sau khi phân phối.Việc thiết lập cả hai cấu hình nam châm là một thách thức do cường độ từ trường cao sẽ hút hoặc đẩy nam châm tương ứng.Sau đó, thiết lập được thay đổi thành một nam châm duy nhất song song với đường thở nhưng đi qua đường thở ở góc 90 độ sao cho các đường sức xuyên qua thành khí quản một cách trực giao (Hình 3d), một hướng nhằm xác định khả năng kết tụ hạt trên bức tường bên.được quan sát.Tuy nhiên, trong cấu hình này, không có chuyển động tích lũy MF hoặc chuyển động nam châm có thể xác định được.Dựa trên tất cả các kết quả này, một cấu hình với một nam châm duy nhất và hướng 30 độ đã được chọn cho các nghiên cứu in vivo về chất mang gen (Hình 3a).
Khi con vật được chụp ảnh nhiều lần ngay sau khi bị hy sinh một cách nhân đạo, việc không có chuyển động mô cản trở có nghĩa là có thể thấy rõ các đường hạt ngắn hơn, mịn hơn trong trường liên sụn rõ ràng, 'lắc lư' theo chuyển động tịnh tiến của nam châm.thấy rõ sự hiện diện và chuyển động của các hạt MP6.
Hiệu giá của LV-LacZ là 1,8 x 108 IU/mL và sau khi trộn với CombiMag MP (MP6) theo tỷ lệ 1:1, động vật được tiêm 50 µl phương tiện LV 9 x 107 IU/ml vào khí quản (tức là 4,5 x 106 TU/chuột).).).).Trong các nghiên cứu này, thay vì di chuyển nam châm trong quá trình chuyển dạ, chúng tôi đã cố định nam châm ở một vị trí để xác định xem liệu sự tải nạp LV có thể (a) được cải thiện so với việc truyền vector khi không có từ trường hay không và (b) liệu đường thở có thể được tập trung.Các tế bào được tải nạp trong các khu vực mục tiêu từ tính của đường hô hấp trên.
Sự hiện diện của nam châm và việc sử dụng CombiMag kết hợp với vectơ LV dường như không ảnh hưởng xấu đến sức khỏe động vật, cũng như giao thức phân phối vectơ LV tiêu chuẩn của chúng tôi.Hình ảnh phía trước của vùng khí quản chịu nhiễu loạn cơ học (Hình bổ sung 1) cho thấy nhóm được xử lý LV-MP có mức tải nạp cao hơn đáng kể khi có nam châm (Hình 9a).Chỉ có một lượng nhỏ nhuộm LacZ màu xanh trong nhóm đối chứng (Hình 9b).Định lượng các vùng được chuẩn hóa nhuộm màu X-Gal cho thấy việc sử dụng LV-MP khi có từ trường dẫn đến cải thiện khoảng 6 lần (Hình 9c).
Ví dụ về hình ảnh tổng hợp cho thấy sự tải nạp khí quản với LV-MP (a) khi có từ trường và (b) khi không có nam châm.(c) Cải thiện đáng kể về mặt thống kê trong khu vực tải nạp LacZ chuẩn hóa trong khí quản khi sử dụng nam châm (*p = 0,029, t-test, n = 3 mỗi nhóm, trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình).
Các phần nhuộm màu đỏ nhanh trung tính (ví dụ được hiển thị trong Hình bổ sung 2) chỉ ra rằng các tế bào nhuộm LacZ có mặt trong cùng một mẫu và ở cùng một vị trí như đã báo cáo trước đó.
Thách thức chính trong liệu pháp gen đường thở vẫn là định vị chính xác các hạt mang trong các khu vực quan tâm và đạt được hiệu quả tải nạp cao trong phổi di động khi có luồng không khí và hoạt động thanh thải chất nhầy.Đối với chất mang LV nhằm mục đích điều trị các bệnh về đường hô hấp trong bệnh xơ nang, việc tăng thời gian cư trú của các hạt mang trong đường dẫn khí cho đến nay vẫn là một mục tiêu không thể đạt được.Như Castellani và cộng sự đã chỉ ra, việc sử dụng từ trường để tăng cường tải nạp có lợi thế hơn các phương pháp chuyển gen khác như điện di vì nó có thể kết hợp tính đơn giản, kinh tế, chuyển giao cục bộ, tăng hiệu quả và thời gian ủ ngắn hơn.và có thể là liều lượng phương tiện thấp hơn10.Tuy nhiên, sự lắng đọng in vivo và hành vi của các hạt từ tính trong đường thở dưới tác động của lực từ bên ngoài chưa bao giờ được mô tả và trên thực tế, khả năng của phương pháp này để tăng mức độ biểu hiện gen trong đường thở sống còn nguyên vẹn chưa được chứng minh in vivo.
Các thí nghiệm trong ống nghiệm của chúng tôi trên synchrotron PCXI cho thấy rằng tất cả các hạt mà chúng tôi đã thử nghiệm, ngoại trừ polystyrene MP, đều có thể nhìn thấy trong thiết lập hình ảnh mà chúng tôi đã sử dụng.Khi có từ trường, từ trường tạo thành các chuỗi, độ dài của chuỗi có liên quan đến loại hạt và cường độ của từ trường (tức là khoảng cách gần và chuyển động của nam châm).Như thể hiện trong Hình 10, các dây mà chúng ta quan sát được hình thành khi mỗi hạt riêng lẻ bị từ hóa và tạo ra từ trường cục bộ của chính nó.Các trường riêng biệt này làm cho các hạt tương tự khác thu thập và kết nối với các chuyển động của chuỗi nhóm do các lực cục bộ từ lực hút và lực đẩy cục bộ của các hạt khác.
Sơ đồ hiển thị (a, b) chuỗi các hạt hình thành bên trong các mao mạch chứa đầy chất lỏng và (c, d) khí quản chứa đầy không khí.Lưu ý rằng các mao mạch và khí quản không được vẽ theo tỷ lệ.Bảng (a) cũng chứa mô tả về MF chứa các hạt Fe3O4 được sắp xếp theo chuỗi.
Khi nam châm di chuyển qua mao quản, góc của chuỗi hạt đạt đến ngưỡng tới hạn đối với MP3-5 chứa Fe3O4, sau đó chuỗi hạt không còn ở vị trí ban đầu mà di chuyển dọc theo bề mặt đến một vị trí mới.nam châm.Hiệu ứng này có thể xảy ra do bề mặt của mao quản thủy tinh đủ nhẵn để cho phép chuyển động này xảy ra.Điều thú vị là MP6 (CombiMag) không hoạt động theo cách này, có lẽ vì các hạt nhỏ hơn, có lớp phủ hoặc điện tích bề mặt khác hoặc chất lỏng mang độc quyền ảnh hưởng đến khả năng di chuyển của chúng.Độ tương phản trong hình ảnh hạt CombiMag cũng yếu hơn, cho thấy chất lỏng và hạt có thể có mật độ giống nhau và do đó không thể dễ dàng di chuyển về phía nhau.Các hạt cũng có thể bị kẹt nếu nam châm di chuyển quá nhanh, cho thấy cường độ từ trường không phải lúc nào cũng vượt qua ma sát giữa các hạt trong chất lỏng, cho thấy cường độ từ trường và khoảng cách giữa nam châm và khu vực mục tiêu không phải là bất ngờ.quan trọng.Những kết quả này cũng chỉ ra rằng mặc dù nam châm có thể bắt giữ nhiều vi hạt chảy qua khu vực mục tiêu, nhưng không chắc rằng nam châm có thể được dựa vào để di chuyển các hạt CombiMag dọc theo bề mặt của khí quản.Do đó, chúng tôi đã kết luận rằng các nghiên cứu in vivo LV MF nên sử dụng từ trường tĩnh để nhắm mục tiêu vật lý vào các khu vực cụ thể của cây đường thở.
Sau khi các hạt được đưa vào cơ thể, chúng rất khó xác định trong bối cảnh mô chuyển động phức tạp của cơ thể, nhưng khả năng phát hiện của chúng đã được cải thiện bằng cách di chuyển nam châm theo chiều ngang trên khí quản để “lung rinh” các chuỗi MP.Mặc dù có thể chụp ảnh thời gian thực, nhưng việc phân biệt chuyển động của hạt sẽ dễ dàng hơn sau khi con vật bị giết một cách nhân đạo.Nồng độ MP thường cao nhất tại vị trí này khi nam châm được định vị trên khu vực hình ảnh, mặc dù một số hạt thường được tìm thấy sâu hơn trong khí quản.Không giống như các nghiên cứu trong ống nghiệm, các hạt không thể bị kéo xuống khí quản bằng chuyển động của nam châm.Phát hiện này phù hợp với cách chất nhầy bao phủ bề mặt khí quản thường xử lý các hạt hít vào, nhốt chúng trong chất nhầy và sau đó loại bỏ chúng thông qua cơ chế thanh thải chất nhầy.
Chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng việc sử dụng nam châm bên trên và bên dưới khí quản để thu hút (Hình 3b) có thể tạo ra từ trường đồng đều hơn, thay vì từ trường tập trung cao độ tại một điểm, có khả năng dẫn đến sự phân bố các hạt đồng đều hơn..Tuy nhiên, nghiên cứu sơ bộ của chúng tôi không tìm thấy bằng chứng rõ ràng để hỗ trợ cho giả thuyết này.Tương tự, đặt một cặp nam châm thành lực đẩy (Hình 3c) không dẫn đến nhiều hạt lắng đọng hơn trong vùng hình ảnh.Hai phát hiện này chứng minh rằng thiết lập nam châm kép không cải thiện đáng kể khả năng kiểm soát điểm MP cục bộ và lực từ mạnh tạo ra rất khó điều chỉnh, khiến phương pháp này trở nên kém thực tế hơn.Tương tự, định hướng nam châm ở trên và ngang qua khí quản (Hình 3d) cũng không làm tăng số lượng hạt còn lại trong vùng chụp ảnh.Một số cấu hình thay thế này có thể không thành công vì chúng làm giảm cường độ từ trường trong vùng lắng đọng.Do đó, cấu hình nam châm đơn ở 30 độ (Hình 3a) được coi là phương pháp thử nghiệm in vivo đơn giản và hiệu quả nhất.
Nghiên cứu LV-MP cho thấy rằng khi vectơ LV được kết hợp với CombiMag và được phân phối sau khi bị xáo trộn vật lý khi có từ trường, mức độ tải nạp tăng lên đáng kể trong khí quản so với nhóm chứng.Dựa trên các nghiên cứu hình ảnh synchrotron và kết quả LacZ, từ trường dường như có thể giữ LV trong khí quản và giảm số lượng hạt vectơ ngay lập tức xâm nhập sâu vào phổi.Những cải tiến nhắm mục tiêu như vậy có thể dẫn đến hiệu quả cao hơn trong khi giảm các chuẩn độ được cung cấp, tải nạp không nhắm mục tiêu, tác dụng phụ gây viêm và miễn dịch cũng như chi phí chuyển gen.Điều quan trọng, theo nhà sản xuất, CombiMag có thể được sử dụng kết hợp với các phương pháp chuyển gen khác, bao gồm các vectơ virut khác (chẳng hạn như AAV) và axit nucleic.