Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com.Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế.Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer).Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo được hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Các vectơ gen để điều trị bệnh xơ nang phổi phải được nhắm mục tiêu vào đường dẫn khí, vì sự tải nạp phổi ngoại biên không có tác dụng điều trị.Hiệu quả tải nạp virus liên quan trực tiếp đến thời gian cư trú của người mang mầm bệnh.Tuy nhiên, chất lỏng phân phối như chất mang gen khuếch tán tự nhiên vào phế nang trong quá trình hít vào và các hạt trị liệu ở bất kỳ hình dạng nào sẽ nhanh chóng bị loại bỏ bằng cách vận chuyển chất nhầy.Kéo dài thời gian cư trú của người mang gen trong đường hô hấp là quan trọng nhưng khó đạt được.Các hạt từ tính liên hợp với chất mang có thể hướng tới bề mặt của đường hô hấp có thể cải thiện việc nhắm mục tiêu theo vùng.Do các vấn đề với hình ảnh in vivo, hoạt động của các hạt từ tính nhỏ như vậy trên bề mặt đường thở khi có từ trường tác dụng chưa được hiểu rõ.Mục đích của nghiên cứu này là sử dụng hình ảnh synchrotron để hình dung chuyển động in vivo của một loạt hạt từ tính trong khí quản của chuột bị gây mê nhằm nghiên cứu động lực học và mô hình hành vi của các hạt đơn lẻ và khối lượng lớn trong cơ thể.Sau đó, chúng tôi cũng đánh giá liệu việc cung cấp các hạt từ tính lentivirus khi có từ trường có làm tăng hiệu quả tải nạp trong khí quản chuột hay không.Hình ảnh tia X synchrotron cho thấy hành vi của các hạt từ tính trong từ trường đứng yên và chuyển động trong ống nghiệm và trong cơ thể.Các hạt không thể dễ dàng bị kéo qua bề mặt khí quản sống bằng nam châm, nhưng trong quá trình vận chuyển, cặn sẽ tập trung trong trường nhìn, nơi từ trường mạnh nhất.Hiệu suất tải nạp cũng tăng gấp sáu lần khi các hạt từ tính lentivirus được phân phối khi có từ trường.Kết hợp lại với nhau, những kết quả này cho thấy các hạt từ tính và từ trường lentivirus có thể là những phương pháp có giá trị để cải thiện mức độ tải nạp và nhắm mục tiêu của vectơ gen trong đường dẫn khí in vivo.
Xơ nang (CF) là do các biến thể trong một gen duy nhất gọi là chất điều hòa độ dẫn xuyên màng CF (CFTR).Protein CFTR là một kênh ion có mặt trong nhiều tế bào biểu mô khắp cơ thể, bao gồm cả đường hô hấp, một vị trí chính trong cơ chế bệnh sinh của bệnh xơ nang.Khiếm khuyết trong CFTR dẫn đến vận chuyển nước bất thường, mất nước trên bề mặt đường thở và giảm độ sâu của lớp chất lỏng bề mặt đường thở (ASL).Nó cũng làm suy yếu khả năng của hệ thống vận chuyển chất nhầy (MCT) trong việc làm sạch đường thở của các hạt hít phải và mầm bệnh.Mục tiêu của chúng tôi là phát triển liệu pháp gen lentivirus (LV) để cung cấp bản sao chính xác của gen CFTR và cải thiện ASL, MCT cũng như sức khỏe phổi, đồng thời tiếp tục phát triển các công nghệ mới có thể đo lường các thông số này trong cơ thể sống1.
Các vectơ LV là một trong những ứng cử viên hàng đầu cho liệu pháp gen xơ nang, chủ yếu là do chúng có thể tích hợp vĩnh viễn gen điều trị vào các tế bào đáy đường thở (tế bào gốc đường thở).Điều này rất quan trọng vì chúng có thể khôi phục lại quá trình hydrat hóa và làm sạch chất nhầy bình thường bằng cách biệt hóa thành các tế bào bề mặt đường thở được điều chỉnh gen chức năng có liên quan đến bệnh xơ nang, mang lại lợi ích lâu dài.Các vectơ LV phải hướng vào đường dẫn khí, vì đây là nơi phổi bắt đầu tham gia vào CF.Việc đưa vectơ vào sâu hơn trong phổi có thể dẫn đến sự tải nạp vào phế nang, nhưng điều này không có tác dụng điều trị trong bệnh xơ nang.Tuy nhiên, các chất lỏng như chất mang gen di chuyển tự nhiên vào phế nang khi hít vào sau khi sinh con3,4 và các hạt trị liệu nhanh chóng bị MCT đưa vào khoang miệng.Hiệu quả của việc tải nạp LV liên quan trực tiếp đến khoảng thời gian vectơ vẫn ở gần các tế bào đích để cho phép tế bào hấp thu – “thời gian cư trú”5 dễ dàng được rút ngắn bởi luồng không khí khu vực điển hình cũng như sự hấp thu phối hợp của chất nhầy và các hạt MCT.Đối với bệnh xơ nang, khả năng kéo dài thời gian lưu trú của LV trong đường thở là rất quan trọng để đạt được mức độ tải nạp cao ở khu vực này, nhưng cho đến nay vẫn còn nhiều thách thức.
Để vượt qua rào cản này, chúng tôi đề xuất rằng các hạt từ tính LV (MP) có thể hỗ trợ theo hai cách bổ sung.Đầu tiên, chúng có thể được nam châm dẫn đường đến bề mặt đường thở để cải thiện khả năng nhắm mục tiêu và giúp các hạt mang gen ở đúng khu vực của đường thở;và ASL) di chuyển vào lớp tế bào 6. MP được sử dụng rộng rãi làm phương tiện vận chuyển thuốc nhắm mục tiêu khi chúng liên kết với kháng thể, thuốc hóa trị hoặc các phân tử nhỏ khác gắn vào màng tế bào hoặc liên kết với các thụ thể bề mặt tế bào tương ứng của chúng và tích tụ tại các vị trí khối u trong sự hiện diện của tĩnh điện.Từ trường điều trị ung thư 7. Các phương pháp “siêu nhiệt” khác nhằm mục đích tiêu diệt tế bào khối u bằng cách làm nóng MP khi tiếp xúc với từ trường dao động.Nguyên lý biến đổi từ tính, trong đó từ trường được sử dụng làm tác nhân biến đổi để tăng cường sự chuyển DNA vào tế bào, thường được sử dụng trong ống nghiệm bằng cách sử dụng một loạt các vectơ gen không phải virut và virut cho các dòng tế bào khó tải nạp. ..Hiệu quả của quá trình truyền từ LV với việc đưa LV MP in vitro vào dòng tế bào biểu mô phế quản của con người với sự có mặt của từ trường tĩnh đã được thiết lập, làm tăng hiệu suất tải nạp lên 186 lần so với chỉ sử dụng vectơ LV.LV MT cũng đã được áp dụng cho mô hình in vitro của bệnh xơ nang, trong đó sự truyền từ tính làm tăng sự tải nạp LV trong môi trường nuôi cấy giao diện khí-lỏng lên gấp 20 lần khi có đờm xơ nang10.Tuy nhiên, sự truyền từ của cơ quan in vivo nhận được tương đối ít sự chú ý và chỉ được đánh giá trong một số nghiên cứu trên động vật11,12,13,14,15, đặc biệt là ở phổi16,17.Tuy nhiên, khả năng truyền từ tính trong liệu pháp phổi ở bệnh xơ nang là rõ ràng.Tân và cộng sự.(2020) tuyên bố rằng “một nghiên cứu xác nhận về việc cung cấp các hạt nano từ tính hiệu quả vào phổi sẽ mở đường cho các chiến lược hít CFTR trong tương lai nhằm cải thiện kết quả lâm sàng ở bệnh nhân mắc bệnh xơ nang”6.
Hoạt động của các hạt từ tính nhỏ trên bề mặt đường hô hấp khi có từ trường tác dụng rất khó hình dung và nghiên cứu, do đó chúng khó được hiểu rõ.Trong các nghiên cứu khác, chúng tôi đã phát triển phương pháp Chụp ảnh tia X tương phản pha dựa trên truyền sóng Synchrotron (PB-PCXI) để chụp ảnh không xâm lấn và định lượng những thay đổi nhỏ trong cơ thể sống về độ sâu ASL18 và hành vi MCT19,20 để đo trực tiếp quá trình hydrat hóa bề mặt kênh khí và được sử dụng như một dấu hiệu sớm về hiệu quả điều trị.Ngoài ra, phương pháp tính điểm MCT của chúng tôi sử dụng các hạt có đường kính 10–35 µm bao gồm alumina hoặc thủy tinh có chỉ số khúc xạ cao làm điểm đánh dấu MCT có thể nhìn thấy bằng PB-PCXI21.Cả hai phương pháp đều phù hợp để chụp ảnh nhiều loại hạt, bao gồm cả MP.
Do độ phân giải không gian và thời gian cao, các thử nghiệm ASL và MCT dựa trên PB-PCXI của chúng tôi rất phù hợp để nghiên cứu động lực học và mô hình hành vi của các hạt đơn lẻ và khối lượng lớn trong cơ thể để giúp chúng tôi hiểu và tối ưu hóa các phương pháp phân phối gen MP.Cách tiếp cận mà chúng tôi sử dụng ở đây dựa trên các nghiên cứu của chúng tôi bằng cách sử dụng chùm tia SPring-8 BL20B2, trong đó chúng tôi hình dung ra chuyển động của chất lỏng sau khi đưa một lượng vectơ giả vào đường thở ở mũi và phổi của chuột để giúp giải thích các kiểu biểu hiện gen không đồng nhất của chúng tôi đã quan sát được trong gen của chúng ta.nghiên cứu trên động vật với liều mang là 3,4.
Mục đích của nghiên cứu này là sử dụng synchrotron PB-PCXI để hình dung chuyển động in vivo của một loạt MP trong khí quản của chuột sống.Các nghiên cứu hình ảnh PB-PCXI này được thiết kế để kiểm tra dòng MP, cường độ từ trường và vị trí nhằm xác định tác động của chúng lên chuyển động của MP.Chúng tôi giả định rằng từ trường bên ngoài sẽ giúp MF được phân phối ở lại hoặc di chuyển đến khu vực mục tiêu.Những nghiên cứu này cũng cho phép chúng tôi xác định cấu hình nam châm giúp tối đa hóa lượng hạt còn lại trong khí quản sau khi lắng đọng.Trong loạt nghiên cứu thứ hai, chúng tôi hướng đến việc sử dụng cấu hình tối ưu này để chứng minh mô hình tải nạp do việc phân phối LV-MP in vivo đến đường thở của chuột, với giả định rằng việc phân phối LV-MP trong bối cảnh nhắm mục tiêu đường thở sẽ dẫn đến kết quả trong việc tăng hiệu quả tải nạp LV..
Tất cả các nghiên cứu trên động vật được thực hiện theo các quy trình đã được phê duyệt bởi Đại học Adelaide (M-2019-060 và M-2020-022) và Ủy ban đạo đức động vật Synchrotron SPring-8.Các thí nghiệm được thực hiện theo khuyến nghị của ARRIVE.
Tất cả các hình ảnh x-quang được chụp tại đường truyền tia BL20XU tại synchrotron SPring-8 ở Nhật Bản bằng cách sử dụng thiết lập tương tự như mô tả trước đây21,22.Tóm lại, hộp thí nghiệm được đặt cách vòng lưu trữ synchrotron 245 m.Khoảng cách từ mẫu đến máy dò là 0,6 m được sử dụng cho nghiên cứu hình ảnh hạt và 0,3 m cho nghiên cứu hình ảnh in vivo để tạo hiệu ứng tương phản pha.Sử dụng chùm tia đơn sắc có năng lượng 25 keV.Hình ảnh được thu được bằng cách sử dụng đầu dò tia X có độ phân giải cao (SPring-8 BM3) kết hợp với máy dò sCMOS.Đầu dò chuyển đổi tia X thành ánh sáng khả kiến ​​bằng cách sử dụng bộ phát sáng nhấp nháy dày 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), sau đó được dẫn tới cảm biến sCMOS bằng vật kính hiển vi ×10 (NA 0.3).Máy dò sCMOS là Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Nhật Bản) với kích thước mảng 2048 × 2048 pixel và kích thước pixel thô là 6,5 × 6,5 µm.Cài đặt này mang lại kích thước pixel đẳng hướng hiệu quả là 0,51 µm và trường nhìn khoảng 1,1 mm × 1,1 mm.Thời lượng phơi nhiễm 100 ms được chọn để tối đa hóa tỷ lệ tín hiệu trên tạp âm của các hạt từ tính bên trong và bên ngoài đường thở đồng thời giảm thiểu các tạo tác chuyển động do hơi thở gây ra.Đối với các nghiên cứu in vivo, một màn trập tia X nhanh được đặt trên đường tia X để hạn chế liều bức xạ bằng cách chặn chùm tia X giữa các lần phơi sáng.
Phương tiện LV không được sử dụng trong bất kỳ nghiên cứu hình ảnh PB-PCXI nào của SPring-8 vì buồng hình ảnh BL20XU không được chứng nhận An toàn sinh học Cấp 2.Thay vào đó, chúng tôi đã chọn một loạt MP có đặc tính tốt từ hai nhà cung cấp thương mại bao gồm nhiều kích cỡ, vật liệu, nồng độ sắt và ứng dụng - trước tiên là để hiểu từ trường ảnh hưởng như thế nào đến chuyển động của MP trong mao mạch thủy tinh, sau đó là trong đường hô hấp sống.bề mặt.Kích thước của MP thay đổi từ 0,25 đến 18 µm và được làm từ nhiều vật liệu khác nhau (xem Bảng 1), nhưng thành phần của từng mẫu, bao gồm cả kích thước của các hạt từ tính trong MP, vẫn chưa được biết.Dựa trên các nghiên cứu MCT mở rộng của chúng tôi 19, 20, 21, 23, 24, chúng tôi hy vọng rằng MP có kích thước nhỏ hơn 5 µm có thể được nhìn thấy trên bề mặt đường thở khí quản, chẳng hạn bằng cách trừ các khung hình liên tiếp để thấy khả năng hiển thị chuyển động của MP được cải thiện.Một MP đơn lẻ 0,25 µm nhỏ hơn độ phân giải của thiết bị chụp ảnh, nhưng PB-PCXI được kỳ vọng sẽ phát hiện độ tương phản thể tích của chúng và chuyển động của chất lỏng bề mặt nơi chúng lắng đọng sau khi lắng đọng.
Các mẫu cho mỗi MP trong bảng.1 được điều chế trong mao quản thủy tinh 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) với đường kính trong 0,63 mm.Các hạt cơ thể có sẵn trong nước, trong khi các hạt CombiMag có sẵn trong chất lỏng độc quyền của nhà sản xuất.Mỗi ống chứa đầy một nửa chất lỏng (khoảng 11 µl) và được đặt trên giá đỡ mẫu (xem Hình 1).Các mao quản thủy tinh lần lượt được đặt nằm ngang trên bệ trong buồng hình ảnh và đặt ở các cạnh của chất lỏng.Một nam châm vỏ niken có đường kính 19 mm (dài 28 mm) làm bằng đất hiếm, neodymium, sắt và boron (NdFeB) (N35, cat. No. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) có dư lượng 1,17 T được gắn vào một bảng chuyển riêng biệt để đạt được Thay đổi vị trí của bạn từ xa trong quá trình kết xuất.Chụp ảnh tia X bắt đầu khi nam châm được đặt ở vị trí cao hơn mẫu khoảng 30 mm và hình ảnh thu được ở tốc độ 4 khung hình mỗi giây.Trong quá trình chụp ảnh, nam châm được đưa lại gần ống mao dẫn thủy tinh (ở khoảng cách khoảng 1 mm) rồi di chuyển dọc theo ống để đánh giá ảnh hưởng của cường độ trường và vị trí.
Một thiết lập hình ảnh trong ống nghiệm chứa các mẫu MP trong mao quản thủy tinh ở giai đoạn dịch mã xy.Đường đi của chùm tia X được đánh dấu bằng đường chấm màu đỏ.
Sau khi khả năng hiển thị trong ống nghiệm của MP được thiết lập, một tập hợp con trong số chúng đã được thử nghiệm in vivo trên chuột bạch tạng Wistar cái kiểu hoang dã (~12 tuần tuổi, ~200 g).Medetomidine 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Nhật Bản), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Nhật Bản) và butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Gây mê chuột bằng hỗn hợp Pharma (Nhật Bản) bằng cách tiêm vào màng bụng.Sau khi gây mê, họ được chuẩn bị chụp ảnh bằng cách loại bỏ lông xung quanh khí quản, đặt ống nội khí quản (ET; ống thông tĩnh mạch 16 Ga, Terumo BCT) và cố định chúng ở tư thế nằm ngửa trên một tấm hình ảnh tùy chỉnh có chứa túi nhiệt để duy trì nhiệt độ cơ thể.22. Sau đó, tấm chụp ảnh được gắn vào bệ mẫu trong hộp chụp ảnh ở một góc nhỏ để căn chỉnh khí quản theo chiều ngang trên ảnh X quang như trong Hình 2a.
( a ) Thiết lập hình ảnh in vivo trong bộ tạo ảnh SPring-8, đường đi của tia X được đánh dấu bằng đường chấm màu đỏ.(b, c) Việc định vị nam châm khí quản được thực hiện từ xa bằng cách sử dụng hai camera IP được gắn trực giao.Ở phía bên trái của hình ảnh trên màn hình, bạn có thể thấy vòng dây giữ đầu và ống dẫn khí được lắp bên trong ống ET.
Hệ thống bơm ống tiêm được điều khiển từ xa (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) sử dụng ống tiêm thủy tinh 100 µl được kết nối với ống PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) bằng kim 30 Ga.Đánh dấu ống để đảm bảo đầu ống ở đúng vị trí trong khí quản khi đưa ống nội khí quản vào.Sử dụng một micropump, pít tông ống tiêm được tháo ra và đầu ống được nhúng vào mẫu MP sẽ được phân phối.Ống phân phối đã được nạp sau đó được đưa vào ống nội khí quản, đặt đầu ống ở phần mạnh nhất của từ trường tác dụng dự kiến ​​của chúng ta.Việc thu thập hình ảnh được kiểm soát bằng máy dò hơi thở được kết nối với hộp định giờ dựa trên Arduino của chúng tôi và tất cả các tín hiệu (ví dụ: nhiệt độ, nhịp thở, mở/đóng cửa trập và thu thập hình ảnh) đều được ghi lại bằng Powerlab và LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Khi chụp ảnh Khi không có vỏ, hai camera IP (Panasonic BB-SC382) được đặt ở góc khoảng 90° với nhau và được sử dụng để kiểm soát vị trí của nam châm so với khí quản trong quá trình chụp ảnh (Hình 2b, c).Để giảm thiểu các tạo tác chuyển động, một hình ảnh cho mỗi hơi thở được thu được trong giai đoạn cao nguyên dòng hô hấp cuối cùng.
Nam châm được gắn vào tầng thứ hai, tầng này có thể được đặt từ xa ở bên ngoài thân máy tạo ảnh.Các vị trí và cấu hình khác nhau của nam châm đã được thử nghiệm, bao gồm: đặt ở góc khoảng 30° so với khí quản (cấu hình được thể hiện trong Hình 2a và 3a);một nam châm phía trên con vật và một nam châm ở dưới, với các cực được đặt để thu hút (Hình 3b)., một nam châm phía trên con vật và một nam châm ở dưới, với các cực được đặt để đẩy (Hình 3c), và một nam châm ở trên và vuông góc với khí quản (Hình 3d).Sau khi thiết lập động vật và nam châm, đồng thời nạp MP cần thử nghiệm vào bơm tiêm, cung cấp một liều 50 µl với tốc độ 4 µl/giây khi thu được hình ảnh.Nam châm sau đó được di chuyển qua lại dọc theo hoặc ngang qua khí quản trong khi tiếp tục thu được hình ảnh.
Cấu hình nam châm để chụp ảnh in vivo (a) một nam châm phía trên khí quản ở góc xấp xỉ 30°, (b) hai nam châm được cấu hình để hút, (c) hai nam châm được cấu hình để đẩy, (d) một nam châm ở trên và vuông góc với khí quản.Người quan sát nhìn từ miệng xuống phổi qua khí quản và chùm tia X đi qua bên trái của chuột và thoát ra bên phải.Nam châm được di chuyển dọc theo chiều dài của đường thở hoặc sang trái và phải phía trên khí quản theo hướng của chùm tia X.
Chúng tôi cũng tìm cách xác định khả năng hiển thị và hoạt động của các hạt trong đường thở trong trường hợp không có sự hòa trộn giữa nhịp thở và nhịp tim.Do đó, vào cuối giai đoạn chụp ảnh, động vật đã được an tử nhân đạo do dùng quá liều pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip).Một số động vật được để lại trên bệ chụp ảnh, và sau khi ngừng thở và ngừng tim, quá trình chụp ảnh được lặp lại, bổ sung thêm một liều MP nếu không nhìn thấy MP trên bề mặt đường thở.
Các hình ảnh thu được được hiệu chỉnh để có trường phẳng và tối, sau đó được tập hợp thành phim (20 khung hình mỗi giây; tốc độ bình thường 15–25 × tùy thuộc vào tốc độ hô hấp) bằng cách sử dụng tập lệnh tùy chỉnh được viết bằng MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Tất cả các nghiên cứu về phân phối vectơ gen LV được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu động vật trong phòng thí nghiệm của Đại học Adelaide và nhằm mục đích sử dụng kết quả của thí nghiệm SPring-8 để đánh giá xem liệu phân phối LV-MP khi có từ trường có thể tăng cường chuyển gen trong cơ thể hay không .Để đánh giá tác động của MF và từ trường, hai nhóm động vật đã được điều trị: một nhóm được tiêm LV MF có đặt nam châm và nhóm còn lại được tiêm nhóm đối chứng LV MF không có nam châm.
Các vectơ gen LV đã được tạo ra bằng các phương pháp được mô tả trước đây 25, 26.Vectơ LacZ biểu hiện gen beta-galactosidase định vị trong hạt nhân được điều khiển bởi chất kích thích cấu thành MPSV (LV-LacZ), tạo ra sản phẩm phản ứng màu xanh lam trong các tế bào được tải nạp, có thể nhìn thấy ở mặt trước và các phần của mô phổi.Việc chuẩn độ được thực hiện trong môi trường nuôi cấy tế bào bằng cách đếm thủ công số lượng tế bào dương tính với LacZ bằng máy đo huyết sắc tố để tính hiệu giá tính bằng TU/ml.Vật mang được bảo quản lạnh ở -80°C, rã đông trước khi sử dụng và liên kết với CombiMag bằng cách trộn theo tỷ lệ 1:1 và ủ trên đá ít nhất 30 phút trước khi giao.
Chuột Sprague Dawley bình thường (n = 3/nhóm, ~2-3 ip được gây mê với hỗn hợp 0,4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) và 60mg/kg ketamine (Ilium, Australia) lúc 1 tháng tuổi) ip ) tiêm và đặt ống thông qua đường miệng không phẫu thuật bằng ống thông tĩnh mạch 16 Ga.Để đảm bảo mô đường thở khí quản nhận được sự tải nạp LV, nó được điều hòa bằng cách sử dụng giao thức nhiễu loạn cơ học được mô tả trước đây của chúng tôi, trong đó bề mặt đường thở khí quản được cọ xát theo trục bằng giỏ dây (N-Circle, máy chiết đá nitinol không có đầu NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, Hoa Kỳ) 30 tr28.Sau đó, khoảng 10 phút sau khi xáo trộn tủ an toàn sinh học, việc tiêm LV-MP qua khí quản được thực hiện.
Từ trường được sử dụng trong thí nghiệm này được cấu hình tương tự như nghiên cứu chụp X-quang in vivo, với cùng một nam châm được giữ trên khí quản bằng kẹp stent chưng cất (Hình 4).Một thể tích 50 µl (2 x 25 µl phần dịch) LV-MP được đưa vào khí quản (n = 3 con) bằng pipet có đầu gel như mô tả trước đây.Nhóm đối chứng (n = 3 con) nhận được cùng một LV-MP mà không cần sử dụng nam châm.Sau khi truyền xong, ống thông được lấy ra khỏi ống nội khí quản và động vật được rút ống nội khí quản.Nam châm vẫn ở nguyên vị trí trong 10 phút trước khi tháo ra.Chuột được tiêm dưới da bằng meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia), sau đó gây mê bằng cách tiêm trong phúc mạc 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia).Chuột được giữ ấm và quan sát cho đến khi hồi phục hoàn toàn sau khi gây mê.
Thiết bị phân phối LV-MP trong tủ an toàn sinh học.Bạn có thể thấy ống bọc Luer-lock màu xám nhạt của ống ET nhô ra khỏi miệng và đầu pipet gel như trong hình được đưa qua ống ET đến độ sâu mong muốn vào khí quản.
Một tuần sau quy trình sử dụng LV-MP, động vật được hiến tế nhân đạo bằng cách hít phải 100% CO2 và biểu hiện LacZ được đánh giá bằng phương pháp xử lý X-gal tiêu chuẩn của chúng tôi.Ba vòng sụn đuôi gần nhất đã được loại bỏ để đảm bảo rằng bất kỳ tổn thương cơ học hoặc tình trạng ứ nước nào do đặt ống nội khí quản sẽ không được đưa vào phân tích.Mỗi khí quản được cắt theo chiều dọc để thu được hai nửa để phân tích và đặt vào cốc chứa cao su silicon (Sylgard, Dow Inc) bằng cách sử dụng kim Minutien (Dụng cụ Khoa học Mỹ thuật) để hình dung bề mặt bên trong.Sự phân bố và đặc tính của các tế bào được tải nạp đã được xác nhận bằng cách chụp ảnh chính diện bằng kính hiển vi Nikon (SMZ1500) với máy ảnh DigiLite và phần mềm TCapture (Tucsen Photonics, Trung Quốc).Hình ảnh được thu được ở độ phóng đại 20 lần (bao gồm cài đặt tối đa cho toàn bộ chiều rộng của khí quản), với toàn bộ chiều dài của khí quản được hiển thị từng bước, cung cấp đủ độ chồng chéo giữa mỗi hình ảnh để cho phép hình ảnh được “khâu”.Các hình ảnh từ mỗi khí quản sau đó được kết hợp thành một hình ảnh tổng hợp duy nhất bằng cách sử dụng Composite Image Editor phiên bản 2.0.3 (Microsoft Research) bằng thuật toán chuyển động phẳng. Vùng biểu hiện LacZ trong hình ảnh tổng hợp khí quản của mỗi con vật được định lượng bằng tập lệnh MATLAB tự động (R2020a, MathWorks) như mô tả trước đây28, sử dụng cài đặt 0,35 < Hue < 0,58, Độ bão hòa > 0,15 và Giá trị < 0,7. Vùng biểu hiện LacZ trong hình ảnh tổng hợp khí quản của mỗi con vật được định lượng bằng tập lệnh MATLAB tự động (R2020a, MathWorks) như mô tả trước đây28, sử dụng cài đặt 0,35 < Hue < 0,58, Độ bão hòa > 0,15 và Giá trị < 0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, và использованием настроек 0,35 <отено <0,58, насыщенность> 0,15 và значение <0 ,7. Vùng biểu hiện LacZ trong hình ảnh khí quản tổng hợp từ mỗi con vật được định lượng bằng tập lệnh MATLAB tự động (R2020a, MathWorks) như mô tả trước đây28 bằng cách sử dụng cài đặt 0,350,15 và giá trị<0,7.如前所述,使用自动MATLAB 脚本（R2020a,MathWorks)对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置。如 前所 述 , 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a , Mathworks) 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达量化 , 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。。 .................... HÔNG О Matlab (R2020A, Mathworks), как <0,7 . Các vùng biểu hiện LacZ trên hình ảnh tổng hợp về khí quản của từng con vật được định lượng bằng tập lệnh MATLAB tự động (R2020a, MathWorks) như được mô tả trước đây bằng cách sử dụng cài đặt 0,35 < sắc độ < 0,58, độ bão hòa > 0,15 và giá trị < 0,7 .Bằng cách theo dõi các đường viền của mô trong GIMP v2.10.24, một mặt nạ đã được tạo thủ công cho từng hình ảnh tổng hợp để xác định vùng mô và ngăn chặn bất kỳ phát hiện sai nào bên ngoài mô khí quản.Các vùng được nhuộm màu từ tất cả các hình ảnh tổng hợp của mỗi con vật được cộng lại để đưa ra tổng diện tích được nhuộm màu cho con vật đó.Sau đó, vùng sơn được chia cho tổng diện tích của mặt nạ để có được vùng chuẩn hóa.
Mỗi khí quản được nhúng trong parafin và cắt dày 5 µm.Các phần được nhuộm màu đỏ nhanh trung tính trong 5 phút và hình ảnh được thu được bằng kính hiển vi Nikon Eclipse E400, máy ảnh DS-Fi3 và phần mềm chụp phần tử NIS (phiên bản 5.20.00).
Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện trong GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Ý nghĩa thống kê được đặt ở p 0, 05.Tính quy phạm được kiểm tra bằng phép thử Shapiro-Wilk và sự khác biệt trong nhuộm LacZ được đánh giá bằng phép thử t không ghép cặp.
Sáu MP được mô tả trong Bảng 1 đã được PCXI kiểm tra và khả năng hiển thị được mô tả trong Bảng 2. Hai MP polystyrene (MP1 và MP2; 18 µm và 0,25 µm, tương ứng) không được PCXI nhìn thấy, nhưng các mẫu còn lại có thể được xác định (ví dụ được thể hiện trong Hình 5).MP3 và MP4 có thể nhìn thấy yếu (lần lượt là 10-15% Fe3O4; 0,25 µm và 0,9 µm).Mặc dù MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) chứa một số hạt nhỏ nhất được thử nghiệm nhưng nó lại là hạt rõ rệt nhất.Sản phẩm CombiMag MP6 rất khó phân biệt.Trong mọi trường hợp, khả năng phát hiện MF của chúng tôi đã được cải thiện đáng kể bằng cách di chuyển nam châm qua lại song song với mao quản.Khi nam châm di chuyển ra khỏi mao mạch, các hạt bị kéo ra thành chuỗi dài, nhưng khi nam châm đến gần và cường độ từ trường tăng lên, chuỗi hạt rút ngắn lại khi các hạt di chuyển về phía bề mặt trên của mao quản (xem Video bổ sung S1 : MP4), làm tăng mật độ hạt trên bề mặt.Ngược lại, khi lấy nam châm ra khỏi mao quản, cường độ trường giảm và MP sắp xếp lại thành chuỗi dài kéo dài từ bề mặt trên của mao quản (xem Video bổ sung S2: MP4).Sau khi nam châm ngừng chuyển động, các hạt tiếp tục chuyển động một thời gian sau khi đạt tới vị trí cân bằng.Khi MP di chuyển tới và ra khỏi bề mặt trên của mao quản, các hạt từ tính có xu hướng hút các mảnh vụn qua chất lỏng.
Khả năng hiển thị của MP trong PCXI thay đổi đáng kể giữa các mẫu.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 và (d) MP6.Tất cả các hình ảnh hiển thị ở đây đều được chụp bằng nam châm đặt ngay phía trên mao quản khoảng 10 mm.Các vòng tròn lớn rõ ràng là các bong bóng khí bị mắc kẹt trong các mao mạch, thể hiện rõ nét các đặc điểm viền đen và trắng của hình ảnh tương phản pha.Hộp màu đỏ biểu thị độ phóng đại giúp tăng cường độ tương phản.Lưu ý rằng đường kính của mạch nam châm trong tất cả các hình không theo tỷ lệ và lớn hơn khoảng 100 lần so với hình minh họa.
Khi nam châm di chuyển sang trái và phải dọc theo đỉnh mao quản, góc của dây MP thay đổi để thẳng hàng với nam châm (xem Hình 6), từ đó phác họa các đường sức từ.Đối với MP3-5, sau khi dây cung đạt tới góc ngưỡng, các hạt sẽ kéo dọc theo bề mặt trên của mao quản.Điều này thường dẫn đến việc các MP tập hợp thành các nhóm lớn hơn gần nơi có từ trường mạnh nhất (xem Video bổ sung S3: MP5).Điều này cũng đặc biệt rõ ràng khi chụp ảnh ở gần phần cuối của mao quản, khiến MP tập trung lại và tập trung ở bề mặt phân cách chất lỏng-không khí.Các hạt trong MP6, khó phân biệt hơn so với các hạt trong MP3-5, không kéo khi nam châm di chuyển dọc theo mao mạch, nhưng các chuỗi MP phân tách, để lại các hạt trong tầm nhìn (xem Video bổ sung S4: MP6).Trong một số trường hợp, khi từ trường ứng dụng bị giảm bằng cách di chuyển nam châm một khoảng cách xa khỏi vị trí chụp ảnh, mọi MP còn lại sẽ từ từ rơi xuống bề mặt đáy của ống bằng trọng lực, còn lại trong chuỗi (xem Video bổ sung S5: MP3) .
Góc của dây MP thay đổi khi nam châm di chuyển về bên phải phía trên mao quản.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 và (d) MP6.Hộp màu đỏ biểu thị độ phóng đại giúp tăng cường độ tương phản.Xin lưu ý rằng các video bổ sung chỉ nhằm mục đích cung cấp thông tin vì chúng tiết lộ cấu trúc hạt quan trọng và thông tin động không thể hiển thị được trong những hình ảnh tĩnh này.
Các thử nghiệm của chúng tôi đã chỉ ra rằng việc di chuyển nam châm qua lại chậm dọc theo khí quản sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc hình dung MF trong bối cảnh chuyển động phức tạp trong cơ thể.Không có thử nghiệm in vivo nào được thực hiện vì không thể nhìn thấy các hạt polystyrene (MP1 và MP2) trong mao quản.Mỗi trong số bốn MF còn lại đã được thử nghiệm in vivo với trục dài của nam châm được đặt trên khí quản ở một góc khoảng 30° so với phương thẳng đứng (xem Hình 2b và 3a), vì điều này dẫn đến chuỗi MF dài hơn và hiệu quả hơn hơn nam châm..cấu hình chấm dứt.MP3, MP4 và MP6 chưa được tìm thấy trong khí quản của bất kỳ động vật sống nào.Khi hình dung đường hô hấp của chuột sau khi giết chết động vật một cách nhân đạo, các hạt vẫn không thể nhìn thấy ngay cả khi thể tích bổ sung được thêm vào bằng bơm tiêm.MP5 có hàm lượng oxit sắt cao nhất và là hạt duy nhất có thể nhìn thấy được nên nó được sử dụng để đánh giá và mô tả đặc tính của MP trong cơ thể.
Vị trí của nam châm trên khí quản trong quá trình chèn MF dẫn đến nhiều, nhưng không phải tất cả, MF tập trung vào trường nhìn.Sự xâm nhập của các hạt vào khí quản được quan sát rõ nhất ở động vật được phú dưỡng nhân đạo.Hình 7 và Video bổ sung S6: MP5 cho thấy khả năng bắt và căn chỉnh từ tính nhanh chóng của các hạt trên bề mặt khí quản bụng, cho thấy rằng MP có thể được nhắm mục tiêu đến các khu vực mong muốn của khí quản.Khi tìm kiếm ở xa hơn dọc theo khí quản sau khi truyền MF, một số MF được tìm thấy gần carina hơn, điều này cho thấy cường độ từ trường không đủ để thu thập và giữ tất cả các MF, vì chúng được đưa qua vùng có cường độ từ trường tối đa trong quá trình truyền chất lỏng.quá trình.Tuy nhiên, nồng độ MP sau sinh cao hơn xung quanh khu vực hình ảnh, cho thấy nhiều MP vẫn tồn tại ở những vùng đường thở nơi cường độ từ trường ứng dụng cao nhất.
Hình ảnh (a) trước và (b) sau khi đưa MP5 vào khí quản của một con chuột vừa được phú dưỡng bằng một nam châm được đặt ngay phía trên khu vực chụp ảnh.Khu vực được mô tả nằm giữa hai vòng sụn.Có một số chất lỏng trong đường thở trước khi MP được đưa ra.Hộp màu đỏ biểu thị độ phóng đại giúp tăng cường độ tương phản.Những hình ảnh này được lấy từ video có trong S6: Video bổ sung MP5.
Di chuyển nam châm dọc theo khí quản in vivo dẫn đến sự thay đổi góc của chuỗi MP trên bề mặt đường thở, tương tự như quan sát thấy ở mao mạch (xem Hình 8 và Video bổ sung S7: MP5).Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi, MP không thể bị kéo dọc theo bề mặt đường hô hấp sống như các mao mạch có thể làm.Trong một số trường hợp, chuỗi MP dài ra khi nam châm di chuyển sang trái và phải.Điều thú vị là chúng tôi cũng phát hiện ra rằng chuỗi hạt thay đổi độ sâu của lớp bề mặt chất lỏng khi nam châm di chuyển dọc theo khí quản và giãn nở khi nam châm được di chuyển trực tiếp phía trên và chuỗi hạt được quay sang vị trí thẳng đứng (xem Video bổ sung S7).: MP5 lúc 0:09, dưới cùng bên phải).Kiểu chuyển động đặc trưng thay đổi khi nam châm được di chuyển theo chiều ngang trên đỉnh khí quản (tức là sang trái hoặc phải của con vật, thay vì dọc theo chiều dài của khí quản).Các hạt vẫn có thể nhìn thấy rõ ràng trong quá trình chuyển động của chúng, nhưng khi nam châm được lấy ra khỏi khí quản, các đầu của chuỗi hạt sẽ hiện rõ (xem Video bổ sung S8: MP5, bắt đầu từ 0:08).Điều này phù hợp với đặc tính quan sát được của từ trường dưới tác dụng của từ trường tác dụng trong mao quản thủy tinh.
Hình ảnh mẫu cho thấy MP5 trong khí quản của một con chuột được gây mê còn sống.(a) Nam châm được sử dụng để thu được hình ảnh phía trên và bên trái khí quản, sau đó (b) sau khi di chuyển nam châm sang bên phải.Hộp màu đỏ biểu thị độ phóng đại giúp tăng cường độ tương phản.Những hình ảnh này lấy từ video có trong Video bổ sung của S7: MP5.
Khi hai cực được điều chỉnh theo hướng bắc-nam ở trên và dưới khí quản (tức là thu hút; Hình 3b), các dây MP xuất hiện dài hơn và nằm ở thành bên của khí quản chứ không phải trên bề mặt lưng của khí quản. khí quản (xem Phụ lục).Video S9:MP5).Tuy nhiên, nồng độ cao của các hạt tại một vị trí (tức là bề mặt lưng của khí quản) không được phát hiện sau khi truyền dịch bằng thiết bị nam châm kép, điều này thường xảy ra với thiết bị nam châm đơn.Sau đó, khi một nam châm được cấu hình để đẩy các cực đối diện (Hình 3c), số lượng hạt nhìn thấy được trong trường quan sát không tăng sau khi được phân phối.Việc thiết lập cả hai cấu hình nam châm là một thách thức do cường độ từ trường cao tương ứng hút hoặc đẩy các nam châm.Sau đó, thiết lập được thay đổi thành một nam châm duy nhất song song với đường thở nhưng đi qua đường thở ở góc 90 độ sao cho các đường lực xuyên qua thành khí quản một cách trực giao (Hình 3d), một hướng nhằm xác định khả năng tập hợp các hạt trên bức tường bên.được quan sát.Tuy nhiên, trong cấu hình này, không có chuyển động tích lũy MF hoặc chuyển động nam châm nào có thể xác định được.Dựa trên tất cả những kết quả này, một cấu hình có một nam châm duy nhất và hướng 30 độ đã được chọn cho các nghiên cứu in vivo về người mang gen (Hình 3a).
Khi con vật được chụp ảnh nhiều lần ngay sau khi hiến tế nhân đạo, việc không có chuyển động mô cản trở có nghĩa là các đường hạt mịn hơn, ngắn hơn có thể được nhìn thấy trong trường liên sụn rõ ràng, 'lắc lư' theo chuyển động tịnh tiến của nam châm.thấy rõ sự hiện diện và chuyển động của hạt MP6.
Hiệu giá của LV-LacZ là 1,8 x 108 IU/mL và sau khi trộn theo tỷ lệ 1:1 với CombiMag MP (MP6), động vật được tiêm 50 µl liều khí quản 9 x 107 IU/ml xe LV (tức là 4,5 x 106 TU/chuột).)).).Trong các nghiên cứu này, thay vì di chuyển nam châm trong quá trình chuyển dạ, chúng tôi cố định nam châm ở một vị trí để xác định xem liệu sự tải nạp LV có thể (a) được cải thiện so với việc truyền vectơ khi không có từ trường hay không và (b) liệu đường thở có thể được tập trung.Các tế bào được tải nạp vào vùng mục tiêu từ tính của đường hô hấp trên.
Sự hiện diện của nam châm và việc sử dụng CombiMag kết hợp với vectơ LV dường như không ảnh hưởng xấu đến sức khỏe động vật, cũng như quy trình phân phối vectơ LV tiêu chuẩn của chúng tôi.Hình ảnh phía trước của vùng khí quản chịu nhiễu loạn cơ học (Hình bổ sung 1) cho thấy nhóm được điều trị LV-MP có mức độ tải nạp cao hơn đáng kể khi có nam châm (Hình 9a).Chỉ có một lượng nhỏ chất nhuộm LacZ màu xanh lam xuất hiện trong nhóm đối chứng (Hình 9b).Định lượng các vùng chuẩn hóa được nhuộm X-Gal cho thấy rằng việc sử dụng LV-MP khi có từ trường mang lại sự cải thiện khoảng 6 lần (Hình 9c).
Ví dụ về hình ảnh tổng hợp cho thấy sự dẫn truyền khí quản với LV-MP (a) khi có từ trường và (b) khi không có nam châm.(c) Cải thiện có ý nghĩa thống kê về vùng tải nạp LacZ bình thường trong khí quản khi sử dụng nam châm (*p = 0,029, t-test, n = 3 mỗi nhóm, trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình).
Các phần nhuộm màu đỏ trung tính nhanh (ví dụ được hiển thị trong Hình bổ sung 2) chỉ ra rằng các tế bào nhuộm LacZ có mặt trong cùng một mẫu và ở cùng vị trí như đã báo cáo trước đây.
Thách thức chính trong liệu pháp gen đường thở vẫn là định vị chính xác các hạt mang trong các khu vực quan tâm và đạt được hiệu quả tải nạp ở mức độ cao trong phổi di động khi có luồng khí và hoạt động thanh lọc chất nhầy.Đối với các chất mang LV dùng để điều trị các bệnh về đường hô hấp trong bệnh xơ nang, việc tăng thời gian lưu trú của các hạt mang trong đường dẫn khí cho đến nay vẫn là một mục tiêu không thể đạt được.Như Castellani và cộng sự đã chỉ ra, việc sử dụng từ trường để tăng cường tải nạp có lợi thế hơn các phương pháp chuyển gen khác như điện di vì nó có thể kết hợp tính đơn giản, tính kinh tế, phân phối cục bộ, tăng hiệu quả và thời gian ủ bệnh ngắn hơn.và có thể liều lượng phương tiện thấp hơn10.Tuy nhiên, sự lắng đọng in vivo và hoạt động của các hạt từ tính trong đường thở dưới tác động của lực từ bên ngoài chưa bao giờ được mô tả và trên thực tế, khả năng của phương pháp này trong việc tăng mức độ biểu hiện gen trong đường thở còn nguyên vẹn chưa được chứng minh trên cơ thể.
Các thử nghiệm trong ống nghiệm của chúng tôi trên synchrotron PCXI cho thấy rằng tất cả các hạt mà chúng tôi đã thử nghiệm, ngoại trừ MP polystyrene, đều có thể nhìn thấy được trong thiết lập hình ảnh mà chúng tôi sử dụng.Khi có từ trường, từ trường tạo thành các dây, độ dài của nó liên quan đến loại hạt và cường độ của từ trường (tức là khoảng cách và chuyển động của nam châm).Như được minh họa trong Hình 10, các dây mà chúng ta quan sát được hình thành khi mỗi hạt riêng lẻ bị từ hóa và tạo ra từ trường cục bộ của riêng nó.Các trường riêng biệt này làm cho các hạt tương tự khác tập hợp và kết nối với các chuyển động của chuỗi do lực cục bộ từ lực hút và lực đẩy cục bộ của các hạt khác.
Sơ đồ thể hiện (a, b) chuỗi các hạt hình thành bên trong mao mạch chứa đầy chất lỏng và (c, d) khí quản chứa đầy không khí.Lưu ý rằng các mao mạch và khí quản không được vẽ theo tỷ lệ.Phần (a) cũng chứa phần mô tả về MF chứa các hạt Fe3O4 được sắp xếp thành chuỗi.
Khi nam châm di chuyển qua mao quản, góc của chuỗi hạt đạt đến ngưỡng tới hạn đối với MP3-5 chứa Fe3O4, sau đó chuỗi hạt không còn giữ nguyên vị trí ban đầu mà di chuyển dọc theo bề mặt đến vị trí mới.nam châm.Hiệu ứng này có thể xảy ra do bề mặt của mao quản thủy tinh đủ mịn để cho phép chuyển động này xảy ra.Điều thú vị là MP6 (CombiMag) không hoạt động theo cách này, có lẽ vì các hạt nhỏ hơn, có lớp phủ hoặc điện tích bề mặt khác hoặc chất lỏng mang độc quyền đã ảnh hưởng đến khả năng di chuyển của chúng.Độ tương phản trong hình ảnh hạt CombiMag cũng yếu hơn, cho thấy chất lỏng và hạt có thể có cùng mật độ và do đó không thể dễ dàng di chuyển về phía nhau.Các hạt cũng có thể bị kẹt nếu nam châm di chuyển quá nhanh, cho thấy cường độ từ trường không phải lúc nào cũng thắng được ma sát giữa các hạt trong chất lỏng, cho thấy cường độ từ trường và khoảng cách giữa nam châm và vùng mục tiêu không phải là một sự ngạc nhiên.quan trọng.Những kết quả này cũng chỉ ra rằng mặc dù nam châm có thể thu giữ nhiều vi hạt chảy qua khu vực mục tiêu, nhưng khó có thể dựa vào nam châm để di chuyển các hạt CombiMag dọc theo bề mặt khí quản.Do đó, chúng tôi kết luận rằng các nghiên cứu LV MF in vivo nên sử dụng từ trường tĩnh để nhắm mục tiêu vật lý vào các khu vực cụ thể của cây đường thở.
Một khi các hạt được đưa vào cơ thể, chúng rất khó được xác định trong bối cảnh mô chuyển động phức tạp của cơ thể, nhưng khả năng phát hiện của chúng đã được cải thiện bằng cách di chuyển nam châm theo chiều ngang trên khí quản để “lắc lư” các dây MP.Mặc dù có thể chụp ảnh thời gian thực nhưng việc phân biệt chuyển động của hạt sẽ dễ dàng hơn sau khi con vật bị giết một cách nhân đạo.Nồng độ MP thường cao nhất ở vị trí này khi nam châm được đặt trên vùng chụp ảnh, mặc dù một số hạt thường được tìm thấy sâu hơn ở khí quản.Không giống như các nghiên cứu trong ống nghiệm, các hạt không thể bị kéo xuống khí quản do chuyển động của nam châm.Phát hiện này phù hợp với cách chất nhầy bao phủ bề mặt khí quản thường xử lý các hạt hít vào, giữ chúng trong chất nhầy và sau đó làm sạch chúng thông qua cơ chế thanh thải niêm mạc-lông mi.
Chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng việc sử dụng nam châm ở trên và dưới khí quản để thu hút (Hình 3b) có thể tạo ra từ trường đồng đều hơn, thay vì từ trường tập trung cao độ tại một điểm, có khả năng dẫn đến sự phân bố hạt đồng đều hơn..Tuy nhiên, nghiên cứu sơ bộ của chúng tôi không tìm thấy bằng chứng rõ ràng ủng hộ giả thuyết này.Tương tự, việc đặt một cặp nam châm thành lực đẩy (Hình 3c) không dẫn đến nhiều hạt lắng xuống vùng hình ảnh hơn.Hai phát hiện này chứng minh rằng thiết lập nam châm kép không cải thiện đáng kể khả năng kiểm soát cục bộ của việc trỏ MP và lực từ mạnh tạo ra rất khó điều chỉnh, khiến phương pháp này trở nên kém thực tế hơn.Tương tự, việc định hướng nam châm phía trên và ngang qua khí quản (Hình 3d) cũng không làm tăng số lượng hạt còn lại trong vùng được chụp ảnh.Một số cấu hình thay thế này có thể không thành công vì chúng làm giảm cường độ từ trường trong vùng lắng đọng.Do đó, cấu hình nam châm đơn ở 30 độ (Hình 3a) được coi là phương pháp thử nghiệm in vivo đơn giản và hiệu quả nhất.
Nghiên cứu LV-MP cho thấy rằng khi vectơ LV được kết hợp với CombiMag và được phân phối sau khi bị xáo trộn vật lý khi có từ trường, mức độ tải nạp tăng đáng kể trong khí quản so với đối chứng.Dựa trên các nghiên cứu hình ảnh synchrotron và kết quả LacZ, từ trường dường như có thể giữ LV trong khí quản và làm giảm số lượng hạt vectơ ngay lập tức xâm nhập sâu vào phổi.Những cải tiến nhắm mục tiêu như vậy có thể dẫn đến hiệu quả cao hơn trong khi giảm hiệu giá được phân phối, tải nạp không nhắm mục tiêu, tác dụng phụ gây viêm và miễn dịch cũng như chi phí chuyển gen.Điều quan trọng, theo nhà sản xuất, CombiMag có thể được sử dụng kết hợp với các phương pháp chuyển gen khác, bao gồm các vec tơ virus khác (như AAV) và axit nucleic.