Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com.Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế.Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer).Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Toxoplasma gondii là một ký sinh trùng đơn bào nội bào điều chỉnh môi trường vi mô của vật chủ bị nhiễm bệnh và được biết là có liên quan đến tỷ lệ phát triển khối u não.Trong nghiên cứu này, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng miRNA-21 exosomal từ nhiễm Toxoplasma thúc đẩy sự phát triển của khối u não.Các exosome từ microglia BV2 bị nhiễm Toxoplasma đã được đặc trưng và quá trình nội hóa của các tế bào u thần kinh đệm U87 đã được xác nhận.Hồ sơ biểu hiện microRNA exosomal được phân tích bằng cách sử dụng các mảng microRNA và microRNA-21A-5p liên kết với Toxoplasma gondii và phân loại khối u.Chúng tôi cũng đã nghiên cứu mức độ mRNA của các gen liên quan đến khối u trong các tế bào u thần kinh đệm U87 bằng cách thay đổi mức độ miR-21 trong exosome và tác động của exosome đối với sự tăng sinh tế bào u thần kinh đệm U87 ở người.Trong exosome của các tế bào u thần kinh đệm U87 bị nhiễm Toxoplasma gondii, sự biểu hiện của microRNA-21 tăng lên và hoạt động của các gen kháng khối u (FoxO1, PTEN và PDCD4) bị giảm đi.Các exosome có nguồn gốc từ BV2 bị nhiễm Toxoplasma gây ra sự tăng sinh của các tế bào u thần kinh đệm U87.Exosome gây ra sự phát triển của các tế bào U87 trong mô hình khối u chuột.Chúng tôi đề xuất rằng miR-21 exosomal tăng lên trong microglia BV2 bị nhiễm Toxoplasma có thể đóng một vai trò quan trọng như một chất kích thích tăng trưởng tế bào trong các tế bào u thần kinh đệm U87 bằng cách điều hòa giảm các gen chống ung thư.
Người ta ước tính rằng hơn 18,1 triệu trường hợp ung thư tiến triển đã được chẩn đoán trên toàn thế giới vào năm 2018, với khoảng 297.000 khối u hệ thần kinh trung ương được chẩn đoán mỗi năm (1,6% tổng số khối u)1.Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các yếu tố rủi ro phát triển khối u não ở người bao gồm các sản phẩm hóa chất khác nhau, tiền sử gia đình và bức xạ ion hóa từ thiết bị chẩn đoán và điều trị đầu.Tuy nhiên, nguyên nhân chính xác của những khối u ác tính này vẫn chưa được biết.Khoảng 20% ​​của tất cả các bệnh ung thư trên toàn thế giới là do các tác nhân truyền nhiễm, bao gồm virus, vi khuẩn và ký sinh trùng gây ra3,4.Các mầm bệnh truyền nhiễm làm gián đoạn cơ chế di truyền của tế bào chủ, chẳng hạn như sửa chữa DNA và chu kỳ tế bào, đồng thời có thể dẫn đến viêm mãn tính và tổn thương hệ thống miễn dịch5.
Các tác nhân truyền nhiễm liên quan đến ung thư ở người là mầm bệnh vi-rút phổ biến nhất, bao gồm vi-rút gây u nhú ở người và vi-rút viêm gan B và C.Ký sinh trùng cũng có thể đóng một vai trò tiềm năng trong sự phát triển ung thư ở người.Một số loài ký sinh trùng, cụ thể là Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis và Hymenolepis nana, có liên quan đến nhiều loại ung thư ở người 6,7,8.
Toxoplasma gondii là một động vật nguyên sinh nội bào điều chỉnh môi trường vi mô của các tế bào chủ bị nhiễm bệnh.Ký sinh trùng này được ước tính sẽ lây nhiễm cho khoảng 30% dân số thế giới, khiến toàn bộ dân số gặp nguy hiểm9,10.Toxoplasma gondii có thể lây nhiễm các cơ quan quan trọng, bao gồm cả hệ thống thần kinh trung ương (CNS), và gây ra các bệnh nghiêm trọng như viêm màng não và viêm não gây tử vong, đặc biệt ở những bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch9.Tuy nhiên, Toxoplasma gondii cũng có thể làm thay đổi môi trường của vật chủ bị nhiễm bệnh bằng cách điều chỉnh sự phát triển của tế bào và phản ứng miễn dịch ở những người có khả năng miễn dịch bình thường, dẫn đến việc duy trì tình trạng nhiễm trùng mãn tính không có triệu chứng9,11.Thật thú vị, dựa trên mối tương quan giữa tỷ lệ nhiễm T. gondii và tỷ lệ mắc khối u não, một số báo cáo cho thấy rằng những thay đổi môi trường của vật chủ in vivo do nhiễm T. gondii mãn tính giống với môi trường vi mô của khối u.
Exosome được gọi là thiết bị giao tiếp giữa các tế bào cung cấp nội dung sinh học, bao gồm protein và axit nucleic, từ các tế bào lân cận16,17.Exosome có thể ảnh hưởng đến các quá trình sinh học liên quan đến khối u như chống chết theo chương trình, hình thành mạch và di căn trong môi trường vi mô khối u.Đặc biệt, miRNA (miRNA), RNA nhỏ không mã hóa có chiều dài khoảng 22 nucleotide, là bộ điều chỉnh gen sau phiên mã quan trọng kiểm soát hơn 30% mRNA của con người thông qua phức hợp im lặng do miRNA tạo ra (miRISC).Toxoplasma gondii có thể phá vỡ các quá trình sinh học bằng cách kiểm soát biểu hiện miRNA trong vật chủ bị nhiễm bệnh.Các miRNA của vật chủ chứa các tín hiệu quan trọng để điều chỉnh các quá trình sinh học của vật chủ nhằm đạt được chiến lược sinh tồn của ký sinh trùng.Do đó, nghiên cứu những thay đổi trong hồ sơ miRNA của vật chủ khi bị nhiễm T. gondii có thể giúp chúng ta hiểu rõ hơn về sự tương tác giữa vật chủ và T. gondii.Thật vậy, Thirugnanam et al.15 gợi ý rằng T. gondii thúc đẩy quá trình sinh ung thư não bằng cách thay đổi biểu hiện của nó trên các miRNA của vật chủ cụ thể liên quan đến sự phát triển khối u và phát hiện ra rằng T. gondii có thể gây ra u thần kinh đệm ở động vật thí nghiệm.
Nghiên cứu này tập trung vào sự biến đổi của miR-21 ngoại nhiễm sắc thể ở vi sinh vật chủ bị nhiễm Toxoplasma BV2.Chúng tôi đã quan sát thấy vai trò có thể có của miR-21 exosomal đã thay đổi trong sự phát triển của các tế bào u thần kinh đệm U87 do sự lưu giữ trong nhân của FoxO1/p27, là mục tiêu của miR-21 được biểu hiện quá mức.
Các exosome có nguồn gốc từ BV2 thu được bằng cách sử dụng phương pháp ly tâm vi sai và được xác nhận bằng nhiều phương pháp khác nhau để ngăn ngừa ô nhiễm với các thành phần tế bào hoặc các túi khác.Điện di trên gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) cho thấy các kiểu khác biệt giữa các protein được chiết xuất từ ​​​​tế bào BV2 và exosome (Hình 1A), và các mẫu được đánh giá về sự hiện diện của Alix, được phân tích bằng phương pháp làm mờ dấu hiệu protein exosomal của phương Tây trong .Ghi nhãn alix đã được tìm thấy trong các protein exosome nhưng không có trong các protein ly giải tế bào BV2 (Hình 1 B).Ngoài ra, RNA tinh khiết từ exosome có nguồn gốc từ BV2 đã được phân tích bằng máy phân tích sinh học.Các tiểu đơn vị ribosome 18S và 28S hiếm khi được quan sát thấy trong kiểu di chuyển RNA exosomal, cho thấy độ tinh khiết đáng tin cậy (Hình 1C).Cuối cùng, kính hiển vi điện tử truyền qua cho thấy các exosome quan sát được có kích thước khoảng 60–150nm và có cấu trúc dạng cốc điển hình cho hình thái exosome (Hình 1 D).
Đặc điểm của exosome có nguồn gốc từ các tế bào BV2.(A) Trang bảng dữ liệu an toàn.Protein được phân lập từ các tế bào BV2 hoặc exosome có nguồn gốc từ BV2.Các mẫu protein khác nhau giữa các tế bào và exosome.( B ) Phân tích Western blot của một điểm đánh dấu exosomal (Alix).(C) Đánh giá RNA tinh khiết từ các tế bào BV2 và exosome có nguồn gốc từ BV2 bằng máy phân tích sinh học.Do đó, các tiểu đơn vị ribosome 18S và 28S trong các tế bào BV2 hiếm khi được tìm thấy trong RNA exosome.(D) Kính hiển vi điện tử truyền qua cho thấy các exosome được phân lập từ các tế bào BV2 được nhuộm màu âm tính với 2% uranyl axetat.Exosome có kích thước khoảng 60-150nm và hình cốc (Song và Jung, dữ liệu chưa được công bố).
Quá trình nội hóa tế bào của các exosome có nguồn gốc từ BV2 vào các tế bào u thần kinh đệm ở người U87 đã được quan sát bằng kính hiển vi đồng tiêu.Các exosome được dán nhãn PKH26 được định vị trong tế bào chất của các tế bào U87.Các hạt nhân được nhuộm bằng DAPI (Hình 2A), cho thấy rằng các exosome có nguồn gốc từ BV2 có thể được các tế bào chủ tiếp nhận và ảnh hưởng đến môi trường của các tế bào nhận.
Nội hóa các exosome có nguồn gốc từ BV2 vào các tế bào u thần kinh đệm U87 và các exosome có nguồn gốc từ BV2 bị nhiễm Toxoplasma RH gây ra sự tăng sinh của các tế bào u thần kinh đệm U87.( A ) Các exosome bị nhấn chìm bởi các tế bào U87 được đo bằng kính hiển vi đồng tiêu.Các tế bào u thần kinh đệm U87 được ủ với exosome được dán nhãn PKH26 (màu đỏ) hoặc không kiểm soát trong 24 giờ.Các hạt nhân được nhuộm bằng DAPI (màu xanh) và sau đó được quan sát dưới kính hiển vi đồng tiêu (thanh tỷ lệ: 10 μm, x 3000).( B ) Sự tăng sinh tế bào u thần kinh đệm U87 được xác định bằng xét nghiệm tăng sinh tế bào.Các tế bào u thần kinh đệm U87 được điều trị bằng exosome trong thời gian chỉ định. * P <0,05 thu được bằng bài kiểm tra t của Sinh viên. * P <0,05 thu được bằng bài kiểm tra t của Sinh viên. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. * P <0,05 theo bài kiểm tra t của Sinh viên. *P < 0,05 tỷ lệ tử vong không đáng kể. * P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0,05 thu được bằng cách sử dụng bài kiểm tra t của Sinh viên.
Sau khi xác nhận sự nội hóa của các exosome có nguồn gốc từ BV2 vào các tế bào u thần kinh đệm U87, chúng tôi đã thực hiện các thử nghiệm tăng sinh tế bào để nghiên cứu vai trò của các exosome có nguồn gốc từ Toxoplasma có nguồn gốc từ BV2 trong quá trình phát triển các tế bào u thần kinh đệm ở người.Điều trị các tế bào U87 bằng exosome từ các tế bào BV2 bị nhiễm T. gondii cho thấy các exosome có nguồn gốc từ BV2 bị nhiễm T. gondii gây ra sự tăng sinh của các tế bào U87 cao hơn đáng kể so với đối chứng (Hình 2 B).
Ngoài ra, sự tăng trưởng của các tế bào U118 có kết quả tương tự như U87, vì các exosome kích thích Toxoplasma gây ra mức tăng sinh cao nhất (dữ liệu không được hiển thị).Dựa trên những dữ liệu này, chúng tôi có thể chỉ ra rằng các exosome bị nhiễm Toxoplasma có nguồn gốc từ BV2 đóng một vai trò quan trọng trong sự tăng sinh tế bào u thần kinh đệm.
Để nghiên cứu ảnh hưởng của các exosome có nguồn gốc từ BV2 bị nhiễm Toxoplasma đối với sự phát triển của khối u, chúng tôi đã tiêm tế bào u thần kinh đệm U87 vào chuột trần để tạo mô hình xenograft và tiêm các exosome có nguồn gốc từ BV2 hoặc exosome có nguồn gốc từ BV2 bị nhiễm RH.Sau khi khối u trở nên rõ ràng sau 1 tuần, mỗi nhóm thí nghiệm gồm 5 con chuột được chia theo kích thước khối u để xác định điểm xuất phát giống nhau và kích thước khối u được đo trong 22 ngày.
Ở những con chuột có mô hình xenograft U87, kích thước và trọng lượng khối u lớn hơn đáng kể đã được quan sát thấy ở nhóm exosome nhiễm RH có nguồn gốc từ BV2 vào ngày 22 (Hình 3, B).Mặt khác, không có sự khác biệt đáng kể về kích thước khối u giữa nhóm exosome có nguồn gốc từ BV2 và nhóm đối chứng sau khi điều trị bằng exosome.Ngoài ra, những con chuột được tiêm tế bào u thần kinh đệm và exosome hiển thị trực quan khối lượng khối u lớn nhất trong nhóm exosome có nguồn gốc từ BV2 bị nhiễm RH (Hình 3).Những kết quả này chứng minh rằng các exosome nhiễm Toxoplasma có nguồn gốc từ BV2 gây ra sự phát triển u thần kinh đệm trong mô hình khối u ở chuột.
Sự phát sinh ung thư (AC) của các exosome có nguồn gốc từ BV2 trong mô hình chuột xenograft U87.Kích thước khối u (A) và trọng lượng (B) tăng đáng kể ở chuột trần BALB/c được điều trị bằng exosome bị nhiễm RH có nguồn gốc từ BV2.Chuột trần BALB/c (C) được tiêm dưới da 1 x 107 tế bào U87 lơ lửng trong hỗn hợp Matrigel.Sáu ngày sau khi tiêm, 100 μg exosome có nguồn gốc từ BV2 đã được xử lý ở chuột.Kích thước và trọng lượng khối u được đo tương ứng vào những ngày được chỉ định và sau khi hy sinh. * P <0,05. * P <0,05. *Р < 0,05. * P <0,05. * P < 0,05。 * P < 0,05。 *Р < 0,05. * P <0,05.
Dữ liệu cho thấy 37 miRNA (16 biểu hiện quá mức và 21 biểu hiện kém) liên quan đến khả năng miễn dịch hoặc sự phát triển khối u đã bị thay đổi đáng kể ở microglia sau khi nhiễm chủng Toxoplasma RH (Hình 4A).Mức độ biểu hiện tương đối của miR-21 trong số các miRNA bị thay đổi đã được xác nhận bằng RT-PCR thời gian thực trong exosome có nguồn gốc từ BV2, exosome được xử lý bằng tế bào BV2 và U87.Biểu hiện của miR-21 cho thấy sự gia tăng đáng kể exosome từ các tế bào BV2 bị nhiễm Toxoplasma gondii (chủng RH) (Hình 4B).Mức độ biểu hiện tương đối của miR-21 trong các tế bào BV2 và U87 tăng lên sau khi hấp thụ các exosome đã thay đổi (Hình 4B).Mức độ biểu hiện miR-21 tương đối trong các mô não của bệnh nhân khối u và chuột bị nhiễm Toxoplasma gondii (chủng ME49) tương ứng cao hơn so với nhóm chứng (Hình 4).Những kết quả này tương quan với sự khác biệt giữa mức độ biểu hiện của các microRNA được dự đoán và xác nhận trong ống nghiệm và trong cơ thể sống.
Những thay đổi trong biểu hiện của miP-21a-5p exosomal trong microglia bị nhiễm Toxoplasma gondii (RH).(A) Thể hiện những thay đổi đáng kể trong siRNA liên quan đến khả năng miễn dịch hoặc phát triển khối u sau khi nhiễm T. gondii RH.(B) Các mức biểu hiện miR-21 tương đối được phát hiện bằng RT-PCR thời gian thực trong exosome có nguồn gốc từ BV2, exosome được xử lý bằng BV2 và tế bào U87.(C) Mức độ biểu hiện miR-21 tương đối đã được tìm thấy trong các mô não của bệnh nhân khối u (N=3) và chuột bị nhiễm Toxoplasma gondii (chủng ME49) (N=3). * P <0,05 thu được bằng bài kiểm tra t của Sinh viên. * P <0,05 thu được bằng bài kiểm tra t của Sinh viên. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0,05 thu được bằng cách sử dụng bài kiểm tra t của Sinh viên. *P < 0,05 tỷ lệ tử vong không đáng kể. * P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0,05 thu được bằng cách sử dụng bài kiểm tra t của Sinh viên.
Các exosome từ các tế bào BV2 bị nhiễm RH đã dẫn đến sự phát triển của u thần kinh đệm in vivo và in vitro (Hình 2, 3).Để phát hiện các mRNA có liên quan, chúng tôi đã kiểm tra mức độ mRNA của các gen mục tiêu chống khối u, hộp đầu O1 (FoxO1), PTEN và tế bào chết được lập trình 4 (PDCD4) trong các tế bào U87 bị nhiễm exosome có nguồn gốc từ BV2 hoặc RH BV2.Phân tích tin sinh học đã chỉ ra rằng một số gen liên quan đến khối u, bao gồm gen FoxO1, PTEN và PDCD4, có các vị trí liên kết miR-2121,22.mức độ mRNA của các gen mục tiêu chống khối u đã giảm trong các exosome có nguồn gốc từ BV2 bị nhiễm RH so với các exosome có nguồn gốc từ BV2 (Hình 5A).FoxO1 cho thấy mức protein giảm trong các exosome có nguồn gốc từ BV2 bị nhiễm RH so với các exosome có nguồn gốc từ BV2 (Hình 5B).Dựa trên những kết quả này, chúng tôi có thể xác nhận rằng các exosome có nguồn gốc từ BV2 bị nhiễm RH điều hòa giảm các gen chống ung thư, duy trì vai trò của chúng trong sự phát triển của khối u.
Các exosome có nguồn gốc từ BV2 bị nhiễm Toxoplasma RH gây ra sự ức chế các gen chống ung thư trong các tế bào u thần kinh đệm U87 bằng các exosome có nguồn gốc từ BV2 bị nhiễm Toxoplasma RH.(A) PCR thời gian thực biểu hiện FoxO1, PTEN và PDCD4 trong exosome có nguồn gốc từ BV2 bị nhiễm T. gondii RH so với exosome PBS.mRNA-actin đã được sử dụng làm đối chứng.( B ) Biểu thức FoxO1 được xác định bằng dữ liệu mật độ và mật độ phương Tây được đánh giá thống kê bằng chương trình ImageJ. * P <0,05 thu được bằng bài kiểm tra t của Sinh viên. * P <0,05 thu được bằng bài kiểm tra t của Sinh viên. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0,05 thu được bằng cách sử dụng bài kiểm tra t của Sinh viên. *P < 0,05 tỷ lệ tử vong không đáng kể. * P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0,05 thu được bằng cách sử dụng bài kiểm tra t của Sinh viên.
Để hiểu tác dụng của miP-21 trong exosome đối với sự điều hòa gen liên quan đến khối u, các tế bào U87 đã được thay thế bằng chất ức chế miP-21 bằng Lipofectamine 2000 và các tế bào được thu hoạch sau 24 giờ sau khi truyền.Mức độ biểu hiện FoxO1 và p27 trong các tế bào được thay thế bằng chất ức chế miR-21 được so sánh với các tế bào được điều trị bằng exosome có nguồn gốc từ BV2 bằng cách sử dụng qRT-PCR (Hình 6A, B).Việc truyền chất ức chế miR-21 vào các tế bào U87 đã điều hòa giảm đáng kể biểu hiện FoxO1 và p27 (Hình 6).
MiP-21 có nguồn gốc từ BV2 bị nhiễm RH đã thay đổi biểu hiện FoxO1/p27 trong các tế bào u thần kinh đệm U87.Các tế bào U87 đã được thay thế bằng chất ức chế miP-21 bằng Lipofectamine 2000 và các tế bào đã được thu hoạch 24 giờ sau khi truyền.Mức độ biểu hiện FoxO1 và p27 trong các tế bào được thay thế bằng chất ức chế miR-21 được so sánh với mức độ trong các tế bào được điều trị bằng exosome có nguồn gốc từ BV2 bằng cách sử dụng qRT-PCR (A, B).
Để thoát khỏi phản ứng miễn dịch của vật chủ, ký sinh trùng Toxoplasma biến đổi thành một nang mô.Chúng ký sinh ở các mô khác nhau, bao gồm não, tim và cơ xương, trong suốt vòng đời của vật chủ và điều chỉnh phản ứng miễn dịch của vật chủ.Ngoài ra, chúng có thể điều chỉnh chu kỳ tế bào và quá trình chết theo chương trình của tế bào chủ, thúc đẩy sự sinh sôi nảy nở của chúng14,24.Toxoplasma gondii chủ yếu lây nhiễm các tế bào đuôi gai, bạch cầu trung tính và dòng bạch cầu đơn nhân/đại thực bào, bao gồm cả vi thần kinh đệm não.Toxoplasma gondii gây ra sự khác biệt của các đại thực bào của kiểu hình M2, ảnh hưởng đến quá trình lành vết thương sau khi nhiễm mầm bệnh và cũng liên quan đến quá trình tăng sinh mạch máu và xơ hóa u hạt.Sinh bệnh học hành vi này của nhiễm trùng Toxoplasma có thể liên quan đến các dấu hiệu liên quan đến sự phát triển khối u.Môi trường thù địch do Toxoplasma quy định có thể giống với tiền ung thư tương ứng.Do đó, có thể cho rằng nhiễm Toxoplasma góp phần vào sự phát triển của các khối u não.Trên thực tế, tỷ lệ nhiễm Toxoplasma cao đã được báo cáo trong huyết thanh của bệnh nhân mắc các khối u não khác nhau.Ngoài ra, Toxoplasma gondii có thể là một tác nhân gây ung thư khác và hoạt động hiệp đồng để giúp các chất gây ung thư truyền nhiễm khác phát triển khối u não.Về vấn đề này, điều đáng chú ý là vi rút P. falciparum và Epstein-Barr cùng góp phần vào sự hình thành ung thư hạch Burkitt.
Vai trò của exosome với tư cách là cơ quan quản lý trong lĩnh vực nghiên cứu ung thư đã được nghiên cứu rộng rãi.Tuy nhiên, vai trò của exosome giữa ký sinh trùng và vật chủ bị nhiễm bệnh vẫn chưa được hiểu rõ.Cho đến nay, các cơ quan quản lý khác nhau, bao gồm các protein được tiết ra, đã giải thích các quá trình sinh học mà ký sinh trùng đơn bào chống lại sự tấn công của vật chủ và duy trì sự lây nhiễm.Gần đây, ngày càng có nhiều ý kiến ​​cho rằng các vi hạt liên kết với động vật nguyên sinh và các microRNA của chúng tương tác với các tế bào chủ để tạo ra một môi trường thuận lợi cho sự tồn tại của chúng.Do đó, cần có các nghiên cứu sâu hơn để khám phá mối quan hệ giữa các miRNA exosomal bị thay đổi và sự tăng sinh tế bào u thần kinh đệm.Sự biến đổi microRNA (cụm gen miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 và miR-17-92) liên kết với trình khởi động STAT3 trong đại thực bào ở người bị nhiễm toxoplasma, được điều hòa và gây ra phản ứng kháng -apoptosis để đáp ứng với nhiễm trùng Toxoplasma gondii 29 .Nhiễm Toxoplasma làm tăng biểu hiện của miR-17-5p và miR-106b-5p, có liên quan đến một số bệnh tăng sinh 30 .Những dữ liệu này cho thấy rằng các miRNA của vật chủ được điều chỉnh bởi nhiễm Toxoplasma là những phân tử quan trọng đối với sự sống sót của ký sinh trùng và sinh bệnh học trong hành vi sinh học của vật chủ.
Các miRNA bị thay đổi có thể ảnh hưởng đến các loại hành vi khác nhau trong quá trình bắt đầu và phát triển của các tế bào ác tính, bao gồm u thần kinh đệm: tự cung cấp tín hiệu tăng trưởng, không nhạy cảm với tín hiệu ức chế tăng trưởng, trốn tránh quá trình chết theo chương trình, tiềm năng sao chép không giới hạn, hình thành mạch, xâm lấn và di căn và viêm nhiễm.Trong u thần kinh đệm, các miRNA biến đổi đã được xác định trong một số nghiên cứu về biểu hiện.
Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã xác nhận mức độ biểu hiện miRNA-21 cao trong các tế bào chủ bị nhiễm toxoplasma.miR-21 đã được xác định là một trong những microRNA được biểu hiện quá mức thường xuyên nhất trong các khối u rắn, bao gồm u thần kinh đệm, 33 và biểu hiện của nó tương quan với cấp độ của u thần kinh đệm.Bằng chứng tích lũy cho thấy miR-21 là một gen gây ung thư mới hoạt động như một yếu tố chống apoptotic trong sự phát triển của u thần kinh đệm và được biểu hiện quá mức trong các mô và huyết tương của các khối u ác tính ở não người.Thật thú vị, sự bất hoạt của miR-21 trong các tế bào và mô u thần kinh đệm gây ra sự ức chế tăng sinh tế bào do quá trình chết theo chương trình phụ thuộc vào caspase.Phân tích tin sinh học của các mục tiêu dự đoán miR-21 cho thấy nhiều gen ức chế khối u liên quan đến quá trình chết theo chương trình, bao gồm chết tế bào được lập trình 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN và hộp đầu O1 (FoxO1), với vị trí gắn kết miR-2121..22.38.
FoxO1, là một trong những yếu tố phiên mã (FoxO), có liên quan đến sự phát triển của nhiều loại ung thư ở người và có thể điều chỉnh sự biểu hiện của các gen ức chế khối u như p21, p27, Bim và FasL40.FoxO1 có thể liên kết và kích hoạt các chất ức chế chu kỳ tế bào như p27 để ngăn chặn sự phát triển của tế bào.Hơn nữa, FoxO1 là tác nhân chính của tín hiệu PI3K/Akt và điều chỉnh nhiều quá trình sinh học như tiến trình chu kỳ tế bào và sự biệt hóa tế bào thông qua kích hoạt phiên mã p2742.
Để kết luận, chúng tôi tin rằng miR-21 exosomal có nguồn gốc từ microglia bị nhiễm Toxoplasma có thể đóng một vai trò quan trọng như một chất điều hòa tăng trưởng của các tế bào u thần kinh đệm (Hình 7).Tuy nhiên, cần có các nghiên cứu sâu hơn để tìm ra mối liên hệ trực tiếp giữa miR-21 exosomal, nhiễm Toxoplasma đã thay đổi và sự phát triển của u thần kinh đệm.Những kết quả này dự kiến ​​sẽ cung cấp một điểm khởi đầu để nghiên cứu mối quan hệ giữa nhiễm Toxoplasma và tỷ lệ mắc bệnh u thần kinh đệm.
Một sơ đồ về cơ chế sinh ung thư thần kinh đệm (não) được đề xuất trong nghiên cứu này.Tác giả vẽ bằng PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Tất cả các giao thức thử nghiệm trong nghiên cứu này, bao gồm cả việc sử dụng động vật, đều tuân theo Hướng dẫn đạo đức tiêu chuẩn của Ủy ban chăm sóc động vật và người dùng của Đại học quốc gia Seoul và đã được phê duyệt bởi Hội đồng đánh giá thể chế của Trường Y khoa Đại học quốc gia Seoul (số IRB SNU- 150715).-2).Tất cả các quy trình thử nghiệm đã được thực hiện theo các khuyến nghị ARRIVE.
Microglia của chuột BV2 và tế bào u thần kinh đệm ở người U87 được nuôi cấy trong môi trường Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) của Dulbecco và môi trường của Viện tưởng niệm Roswell Park (RPMI; Welgene), mỗi loại chứa 10% huyết thanh bào thai bò, 4 mM l- glutamine, penicillin 0,2 mM và streptomycin 0,05 mM.Các tế bào được nuôi cấy trong tủ ấm với 5% CO2 ở 37°C.Một dòng tế bào u thần kinh đệm khác, U118, được sử dụng để so sánh với các tế bào U87.
Để phân lập exosome từ các chủng RH và ME49 bị nhiễm T. gondii, T. gondii tachyzoites (chủng RH) được thu hoạch từ khoang bụng của chuột BALB/c 6 tuần tuổi được tiêm 3-4 ngày trước đó.Tachyzoites được rửa ba lần bằng PBS và được tinh chế bằng cách ly tâm trong 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Để thu được tachyzoite của chủng ME49, chuột BALB/c được tiêm trong màng bụng 20 nang mô và sự biến đổi tachyzoite trong nang được thu thập bằng cách rửa khoang bụng vào ngày thứ 6-8 sau khi nhiễm bệnh (PI).Chuột bị nhiễm PBS.ME49 tachyzoites được nuôi cấy trong các tế bào bổ sung 100 μg/ml penicillin (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml streptomycin (Gibco/BRL) và 5% huyết thanh bào thai bò (Lonza, Walkersville, MD ) .., USA) ở 37 °C và 5% carbon dioxide.Sau khi nuôi cấy trong các tế bào Vero, các tachyzoite ME49 được đưa hai lần qua một cây kim cỡ 25 và sau đó qua bộ lọc 5 µm để loại bỏ các mảnh vụn và tế bào.Sau khi rửa, tachyzoites được nối lại trong PBS44.Các u nang mô của chủng Toxoplasma gondii ME49 được duy trì bằng cách tiêm vào màng bụng các u nang được phân lập từ não của những con chuột bị nhiễm C57BL/6 (Trung tâm Động vật Sinh học Phương Đông, Seongnam, Hàn Quốc).Não của những con chuột bị nhiễm ME49 được thu hoạch sau 3 tháng dùng PI và được băm nhỏ dưới kính hiển vi để phân lập u nang.Những con chuột bị nhiễm bệnh được giữ trong điều kiện đặc biệt không có mầm bệnh (SPF) tại Trường Y Đại học Quốc gia Seoul.
Tổng RNA được chiết xuất từ ​​​​exosome, tế bào BV2 và mô có nguồn gốc từ BV2 bằng cách sử dụng miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Đức) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, bao gồm cả thời gian ủ cho bước rửa giải.Nồng độ RNA được xác định trên máy đo quang phổ NanoDrop 2000.Chất lượng của các microarray RNA được đánh giá bằng máy phân tích sinh học Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Hà Lan).
DMEM với 10% FBS nghèo exosome được điều chế bằng siêu ly tâm ở 100.000g trong 16 giờ ở 4°C và được lọc qua bộ lọc 0,22 µm (Nalgene, Rochester, NY, USA).Các tế bào BV2, 5 × 105, được nuôi cấy trong DMEM chứa 10% FBS đã cạn kiệt exosome và 1% kháng sinh ở 37°C và 5% CO2.Sau 24 giờ ủ, tachyzoites của chủng RH hoặc ME49 (MOI = 10) đã được thêm vào các tế bào và các ký sinh trùng không xâm lấn đã bị loại bỏ trong vòng một giờ và được nạp lại bằng DMEM.Exosome từ các tế bào BV2 được phân lập bằng phương pháp ly tâm vi sai đã sửa đổi, phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất.Tái tạo hỗn dịch viên exosome trong 300 µl PBS để phân tích RNA hoặc protein.Nồng độ của các exosome bị cô lập được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm protein BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) và máy đo quang phổ NanoDrop 2000.
Kết tủa từ tế bào BV2 hoặc exosome có nguồn gốc từ BV2 được ly giải trong dung dịch chiết xuất protein PRO-PREP™ (Công nghệ sinh học iNtRon, Seongnam, Hàn Quốc) và protein được nạp vào gel polyacrylamide 10% SDS nhuộm màu xanh rực rỡ của Coomassie.Ngoài ra, protein được chuyển đến màng PVDF trong 2 giờ.Western blots đã được xác nhận bằng cách sử dụng kháng thể Alix (Công nghệ tín hiệu tế bào, Beverly, MA, Hoa Kỳ) làm chất đánh dấu exosomal.IgG (H + L) chống chuột kết hợp với HRP (Phòng thí nghiệm Bethyl, Montgomery, TX, Hoa Kỳ) và máy phân tích hình ảnh phát quang cộng với LAS-1000 (Phim ảnh Fuji, Tokyo, Nhật Bản) đã được sử dụng làm kháng thể thứ cấp..Kính hiển vi điện tử truyền qua đã được thực hiện để nghiên cứu kích thước và hình thái của exosome.Các exosome được phân lập từ các tế bào BV2 (6,40 µg/µl) được chuẩn bị trên các mắt lưới phủ carbon và nhuộm màu âm tính với 2% uranyl axetat trong 1 phút.Các mẫu đã chuẩn bị được quan sát ở điện áp gia tốc 80 kV sử dụng JEOL 1200-EX II (Tokyo, Nhật Bản) được trang bị máy ảnh ES1000W Erlangshen CCD (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Các exosome có nguồn gốc từ BV2 được nhuộm bằng Bộ công cụ liên kết huỳnh quang đỏ PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Hoa Kỳ) trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.Các tế bào U87, 2×105, có exosome được đánh dấu PKH26 (màu đỏ) hoặc không có exosome làm đối chứng âm tính, được ủ ở 37°C trong 24 giờ trong tủ ấm 5% CO2.Nhân tế bào U87 được nhuộm bằng DAPI (màu xanh), các tế bào U87 được cố định trong 4% paraformaldehyde trong 15 phút ở 4°C và sau đó được phân tích trong hệ thống kính hiển vi đồng tiêu Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Đức).quan sát được.
cDNA đã được tổng hợp từ siRNA bằng cách sử dụng tổng hợp chuỗi đầu tiên Mir-X siRNA và bộ SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Nhật Bản).PCR định lượng thời gian thực được thực hiện bằng hệ thống phát hiện PCR thời gian thực iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) bằng cách sử dụng mồi và mẫu được trộn với SYBR Premix.DNA được khuếch đại trong 40 chu kỳ biến tính ở 95°C trong 15 giây và ủ ở 60°C trong 60 giây.Dữ liệu từ mỗi phản ứng PCR được phân tích bằng mô-đun phân tích dữ liệu của phần mềm hệ thống quang học iQ™5 (Bio-Rad).Những thay đổi tương đối trong biểu hiện gen giữa các gen mục tiêu đã chọn và β-actin/siRNA (và U6) được tính toán bằng phương pháp đường cong chuẩn.Trình tự mồi được sử dụng được thể hiện trong Bảng 1.
Các tế bào u thần kinh đệm 3 x 104 U87 được cấy vào các đĩa 96 giếng và trộn với các exosome nhiễm Toxoplasma có nguồn gốc từ BV2 (50 μg/mL) hoặc các exosome không xung có nguồn gốc từ BV2 (50 μg/mL) làm đối chứng ở các thời điểm 12, 18 và 36 giờ .Tốc độ tăng sinh tế bào được xác định bằng cách sử dụng Bộ đếm tế bào-8 (Dojindo, Kumamoto, Nhật Bản) (Hình bổ sung S1-S3) 46 .
Chuột trần BALB/c cái 5 tuần tuổi được mua từ Orient Bio (Seongnam-si, Hàn Quốc) và được nuôi riêng trong lồng vô trùng ở nhiệt độ phòng (22 ± 2°C) và độ ẩm (45 ± 15°C).%) ở nhiệt độ phòng (22±2°C) và độ ẩm (45±15%).Chu kỳ sáng 12 giờ và chu kỳ tối 12 giờ được thực hiện theo SPF (Trung tâm Động vật Đại học Y khoa Đại học Quốc gia Seoul).Chuột được chia ngẫu nhiên thành ba nhóm, mỗi nhóm 5 con và tất cả các nhóm được tiêm dưới da 400 ml PBS chứa 1 x 107 tế bào u thần kinh đệm U87 và yếu tố tăng trưởng làm giảm BD Matrigel™ (Khoa học BD, Miami, FL, Hoa Kỳ).Sáu ngày sau khi tiêm khối u, 200 mg exosome có nguồn gốc từ tế bào BV2 (có/không nhiễm Toxoplasma) đã được tiêm vào vị trí khối u.22 ngày sau khi lây nhiễm khối u, kích thước khối u của chuột trong mỗi nhóm được đo bằng thước cặp ba lần một tuần và thể tích khối u được tính theo công thức: 0,5 × (chiều rộng) × 2 × chiều dài.
Phân tích biểu hiện microRNA bằng cách sử dụng mảng miRNA miRCURYTM LNA, thế hệ thứ 7 có mảng mmu và rno (EXIQON, Vedbaek, Đan Mạch) bao gồm 1119 con chuột có đặc điểm nổi bật trong số 3100 đầu dò bắt giữ miRNA của người, chuột nhắt và chuột cống.Trong quy trình này, 250 đến 1000 ng RNA tổng số đã được loại bỏ khỏi 5′-photphat bằng cách xử lý với phosphatase kiềm trong ruột bê, sau đó dán nhãn bằng thuốc nhuộm huỳnh quang xanh lục Hy3.Các mẫu được dán nhãn sau đó được lai bằng cách tải các phiến kính microarray bằng cách sử dụng bộ buồng lai (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) và một bộ lam lai (Agilent Technologies).Phép lai được thực hiện trong 16 giờ ở 56°C, sau đó các vi mảng được rửa theo khuyến nghị của nhà sản xuất.Các slide microarray đã xử lý sau đó được quét bằng hệ thống máy quét microarray Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Hình ảnh quét được nhập bằng phần mềm Trích xuất tính năng Agilent phiên bản 10.7.3.1 (Công nghệ Agilent) và cường độ huỳnh quang của mỗi hình ảnh được định lượng bằng tệp GAL tương ứng của giao thức Exiqon đã sửa đổi.Dữ liệu microarray cho nghiên cứu hiện tại được gửi vào cơ sở dữ liệu GEO theo số gia nhập GPL32397.
Hồ sơ biểu hiện của các miRNA exosomal trưởng thành trong microglia của các chủng RH hoặc ME49 bị nhiễm Toxoplasma đã được phân tích bằng các công cụ mạng khác nhau.miRNA liên quan đến sự phát triển khối u đã được xác định bằng miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) và được lọc ra với cường độ tín hiệu chuẩn hóa (log2) lớn hơn 8,0.Trong số các miRNA, các miRNA được biểu thị khác biệt đã được phát hiện là bị thay đổi hơn 1,5 lần bằng cách phân tích bộ lọc của các miRNA bị thay đổi bởi các chủng RH hoặc ME49 bị nhiễm T. gondii.
Các tế bào được gieo vào các đĩa sáu giếng (3 x 105 tế bào/giếng) trong opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) bằng Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Các tế bào đã chuyển nhiễm được nuôi cấy trong 6 giờ và sau đó môi trường được thay đổi thành môi trường hoàn chỉnh mới.Các tế bào đã được thu hoạch 24 giờ sau khi truyền.
Phân tích thống kê chủ yếu được thực hiện bằng cách sử dụng bài kiểm tra t của Sinh viên với phần mềm Excel (Microsoft, Washington, DC, USA).Để phân tích động vật thí nghiệm, ANOVA hai chiều đã được thực hiện bằng phần mềm Prism 3.0 (Phần mềm GraphPad, La Jolla, CA, Hoa Kỳ). Giá trị P <0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. Giá trị P <0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Giá trị P <0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Giá trị P <0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
Tất cả các giao thức thử nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu này đã được phê duyệt bởi Hội đồng Đánh giá Thể chế của Trường Y Đại học Quốc gia Seoul (số IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. và cộng sự.Ước tính tỷ lệ mắc và tử vong do ung thư toàn cầu năm 2018: Nguồn và phương pháp GLOBOCAN.Diễn dịch.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Một cái nhìn sâu sắc về các yếu tố nguy cơ của khối u não và các can thiệp điều trị của chúng. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Một cái nhìn sâu sắc về các yếu tố nguy cơ của khối u não và các can thiệp điều trị của chúng.Rashid, S., Rehman, K. và Akash, MS Đánh giá các yếu tố nguy cơ đối với khối u não và các biện pháp can thiệp điều trị chính. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Hiểu biết sâu sắc về các yếu tố nguy cơ gây u não và các biện pháp can thiệp điều trị.Rashid, S., Rehman, K. và Akash, MS Đánh giá các yếu tố nguy cơ đối với khối u não và các biện pháp can thiệp điều trị chính.Khoa học y sinh.Dược sĩ.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Tương tác giữa vi khuẩn và vi rút trong ung thư đường sinh dục nữ và đường tiêu hóa ở người: Tóm tắt bằng chứng dịch tễ học và phòng thí nghiệm. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Tương tác giữa vi khuẩn và vi rút trong ung thư đường sinh dục nữ và đường tiêu hóa ở người: Tóm tắt bằng chứng dịch tễ học và phòng thí nghiệm.Kato I., Zhang J. và Sun J. Tương tác vi khuẩn-virus trong ung thư đường tiêu hóa ở người và đường sinh dục nữ: tóm tắt dữ liệu dịch tễ học và phòng thí nghiệm. Kato, I., Zhang, J. và Sun, J. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Tương tác vi khuẩn-virus trong quá trình tiêu hóa khoang miệng của con người và đường sinh sản nữ: tóm tắt về khoa học bệnh phổ biến và bằng chứng trong phòng thí nghiệm.Kato I., Zhang J. và Sun J. Tương tác vi khuẩn-virus trong ung thư đường tiêu hóa ở người và ung thư bộ phận sinh dục nữ: tóm tắt dữ liệu dịch tễ học và phòng thí nghiệm.Ung thư 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Từ nhiễm trùng đến ung thư: Làm thế nào virus khối u DNA thay đổi chuyển hóa carbon và lipid trung tâm của tế bào chủ. Magon, KL & Parish, JL Từ nhiễm trùng đến ung thư: Làm thế nào virus khối u DNA thay đổi chuyển hóa carbon và lipid trung tâm của tế bào chủ.Mahon, KL và Parish, JL Lây nhiễm sang ung thư: làm thế nào virus khối u dựa trên DNA làm thay đổi quá trình chuyển hóa carbon và lipid trung tâm của tế bào chủ. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢. Magon, KL & Parish, JL Từ nhiễm trùng đến ung thư: cách thức virus khối u DNA thay đổi chuyển hóa carbon và lipid trung tâm của tế bào chủ.Mahon, KL và Parish, JL Gây ra sự lây nhiễm sang bệnh ung thư: cách thức virus khối u DNA thay đổi quá trình chuyển hóa carbon và lipid trung tâm trong tế bào chủ.Sinh học mở.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Catechol estrogen của sán máng và sán lá gan và ung thư liên quan đến giun sán.đổi diện.nóng bên trong.5, 444 (2014).