Giardia tá tràng là một sinh vật ký sinh gây bệnh giardia, một bệnh nhiễm trùng đường ruột đặc biệt phổ biến ở trẻ nhỏ có dấu hiệu lâm sàng là tiêu chảy.Trước đây chúng tôi đã báo cáo rằng G. tá tràng ngoại bào kích hoạt sự kích hoạt các nucleotide liên kết với thụ thể giống như oligome hóa 3 (NLRP3) nội bào và điều chỉnh phản ứng viêm của vật chủ thông qua bài tiết túi ngoại bào (EV).Tuy nhiên, các kiểu phân tử chính xác của vi khuẩn EV tá tràng liên quan đến mầm bệnh (GEV) liên quan đến quá trình này và vai trò của hồng cầu NLRP3 trong bệnh giardia vẫn chưa được làm rõ.
Các plasmid biểu hiện nhân thực tái tổ hợp pcDNA3.1(+)-alpha-2 và alpha-7.3 giardin trong GEV đã được tạo ra, chuyển vào các đại thực bào phúc mạc nguyên phát của chuột và được phát hiện bằng cách đo phân tử mục tiêu viêm caspase-1.Mức biểu hiện p20 đã được sàng lọc..G. Duodenalis alpha-2 và alpha-7.3 giardines ban đầu được xác định bằng cách đo hồng cầu NLRP3 (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 và caspase-1 p20), bài tiết IL.1β, mức độ oligome hóa protein đốm apoptotic (ASC) và nội địa hóa miễn dịch huỳnh quang của NLRP3 và ASC.Sau đó, vai trò của dòng siêu vi NLRP3 đối với khả năng gây bệnh của G. tá tràng được đánh giá bằng cách sử dụng những con chuột đã bị chặn hoạt hóa NLRP3 (chuột bị chặn NLRP3) và theo dõi những thay đổi bệnh lý về trọng lượng cơ thể, lượng ký sinh trùng tá tràng và mô tá tràng.Ngoài ra, chúng tôi đã nghiên cứu xem liệu hiardines alpha-2 và alpha-7.3 có kích thích sự tiết IL-1β in vivo thông qua dòng tế bào NLRP3 hay không và xác định vai trò của các phân tử này trong khả năng gây bệnh của G. tá tràng ở chuột.
Giardines Alpha-2 và alpha-7.3 gây ra sự kích hoạt dòng hồng cầu NLRP3 trong ống nghiệm.Điều này dẫn đến việc kích hoạt p20 caspase-1, tăng mức độ biểu hiện của các protein NLRP3, pro-IL-1β và pro-caspase-1, tăng đáng kể sự tiết IL-1β, hình thành các điểm ASA trong tế bào chất và cảm ứng quá trình oligome hóa ASA.Viêm NLRP3 Mất dương vật làm trầm trọng thêm khả năng gây bệnh của G. tá tràng ở chuột.Những con chuột được điều trị bằng u nang bằng ống thông từ những con chuột bị chặn NLRP3 biểu hiện số lượng thể tư dưỡng tăng lên và tổn thương nghiêm trọng đối với nhung mao tá tràng, đặc trưng bởi các hốc hoại tử bị co lại và phân nhánh.Các thí nghiệm in vivo đã chỉ ra rằng giardines alpha-2 và alpha-7.3 có thể tạo ra sự tiết IL-1β thông qua dòng tế bào NLRP3, và việc chủng ngừa bằng giardines alpha-2 và alpha-7.3 làm giảm khả năng gây bệnh của G. tá tràng ở chuột.
Kết hợp lại với nhau, kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng giardia alpha-2 và alpha-7.3 gây ra sự điều hòa tăng cường tình trạng viêm NLRP3 của vật chủ và làm giảm khả năng lây nhiễm của G. tá tràng ở chuột, là mục tiêu đầy hứa hẹn để ngăn ngừa bệnh giardia.
Giardia tá tràng là một loại ký sinh trùng đơn bào ngoại bào sống trong ruột non và gây ra 280 triệu trường hợp nhiễm giardia kèm theo tiêu chảy hàng năm, đặc biệt là ở trẻ nhỏ ở các nước đang phát triển [1].Người ta bị nhiễm bệnh do uống nước hoặc thực phẩm bị nhiễm u nang M. tá tràng, sau đó chúng xâm nhập vào dạ dày và được bài tiết qua dịch dạ dày.Giardia tá tràng trophozoites bám vào biểu mô tá tràng, gây buồn nôn, nôn, tiêu chảy, đau bụng và sụt cân.Những người bị suy giảm miễn dịch và xơ nang dễ bị nhiễm trùng.Nhiễm trùng cũng có thể xảy ra qua quan hệ tình dục bằng miệng và hậu môn [2].Các loại thuốc như metronidazole, tinidazole và nitazoxanide là những lựa chọn điều trị ưu tiên cho nhiễm trùng tá tràng [3].Tuy nhiên, những loại thuốc hóa trị này gây ra tác dụng phụ bất lợi như buồn nôn, gây ung thư và nhiễm độc gen [4].Vì vậy, cần phải phát triển các chiến lược hiệu quả hơn để ngăn ngừa nhiễm trùng G. tá tràng.
Inflammasome là một nhóm phức hợp protein tế bào là một phần của phản ứng miễn dịch bẩm sinh, giúp bảo vệ chống lại sự xâm nhập của mầm bệnh và làm trung gian cho các phản ứng viêm [5].Trong số các thể siêu nhỏ này, thể hồng cầu oligome hóa liên kết với nucleotide (NOD) 3 (NLRP3) liên kết với nucleotide (NLRP3) đã được nghiên cứu rộng rãi vì nó có thể được phát hiện bằng nhiều mẫu phân tử liên quan đến mầm bệnh/tổn thương (PAMP/ DAMP), nhận biết, kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh.và điều hòa cân bằng nội môi đường ruột trong nhiều bệnh viêm nhiễm [6,7,8].Nó bao gồm thụ thể nhận dạng mẫu (PRR) NLRP3, một protein phát hiện apoptotic bộ chuyển đổi (ASC) và một bộ tác động Procaspase-1 hoặc Procaspase-11.Inflammasome NLRP3 hoạt động như một vật chủ chống lại sự xâm nhập của mầm bệnh, như được quan sát trong các nghiên cứu Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] và Leishmania.[11], nhưng cũng đã có báo cáo rằng việc kích hoạt dòng siêu nhỏ NLRP3 sẽ hạn chế các phản ứng miễn dịch bảo vệ và làm trầm trọng thêm sự tiến triển của bệnh, chẳng hạn như ở giun [12].Dựa trên những phát hiện trước đây của chúng tôi, chúng tôi đã báo cáo rằng G. tá tràng ngoại bào kích hoạt sự kích hoạt nội bào của tình trạng viêm NLRP3 và điều chỉnh các phản ứng viêm của vật chủ bằng cách tiết ra các túi ngoại bào (EV) [13].Tuy nhiên, vai trò của dòng siêu nhỏ NLRP3 trong nhiễm trùng G. tá tràng in vivo vẫn chưa được xác định.
Giardin ban đầu được mô tả là thành phần cấu trúc của bộ xương tế bào G. tá tràng và đóng một vai trò quan trọng trong khả năng vận động của trophozoite và sự gắn kết tế bào biểu mô ở ruột non.Để thích nghi tốt hơn với môi trường và tăng khả năng gây bệnh, các trophozoites G. tá tràng đã phát triển một cấu trúc khung tế bào độc đáo bao gồm 8 roi, 1 thân giữa và 1 đĩa bụng [14].Thể tư dưỡng của Giardia tá tràng sử dụng bộ khung tế bào của chúng để xâm nhập vào phần trên của ruột non, đặc biệt là tá tràng và bám vào tế bào ruột.Chúng liên tục di chuyển và gắn vào các tế bào biểu mô bằng quá trình trao đổi chất của tế bào.Vì vậy, có một mối quan hệ chặt chẽ giữa bộ xương tế bào và độc lực của chúng.Giardines đặc hiệu cho Giardia tá tràng là thành phần của cấu trúc khung tế bào [15] và được chia thành bốn lớp: α-, β-, γ- và δ-giardines.Có 21 thành viên thuộc họ α-giardin, tất cả đều có khả năng phụ thuộc vào canxi để liên kết phospholipid [16].Chúng cũng kết nối bộ khung tế bào với màng tế bào.Ở những người bị tiêu chảy do G. tá tràng gây ra, α-giardin được biểu hiện cao và có khả năng miễn dịch trong quá trình nhiễm trùng [17].Vắc-xin dị loại dựa trên Giardia alfa-1 được bảo vệ chống lại bệnh giardia ở chuột và là kháng nguyên ứng cử viên tiềm năng để phát triển vắc-xin [18].Alpha-8 giardin, định vị trong màng sinh chất và tiên mao, nhưng không có trong đĩa bụng, giúp tăng cường khả năng vận động và tốc độ phát triển của thể tư dưỡng ở G. tá tràng [19].Alpha-14 giardin gắn vào cấu trúc vi ống trên roi và ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của G. tá tràng [20].Alpha-11 giardine hiện diện rất nhiều trong suốt vòng đời và sự biểu hiện quá mức của alpha-11 giardine sẽ gây hại cho chính G. Duodenalis [21].Tuy nhiên, vẫn chưa rõ liệu alpha-2 giardine và alpha-7.3 giardine có bảo vệ chống lại nhiễm trùng G. tá tràng và các cơ chế cơ bản của chúng hay không.
Trong nghiên cứu này, các plasmid biểu hiện nhân thực tái tổ hợp pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine và pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine đã được chuyển vào đại thực bào phúc mạc nguyên phát của chuột để kích hoạt NLRP3 của vật chủ.Các mục tiêu gây sốt sau đó đã được sàng lọc.Chúng tôi cũng đã đánh giá vai trò của dòng hồng cầu NLRP3 đối với khả năng gây bệnh của G. Duodenalis, nghiên cứu xem liệu giardines alpha-2 và alpha-7,3 có kích hoạt sự kích hoạt của dòng hồng cầu NLRP3 in vivo hay không và xác định rằng hai vai trò này của giardines trong khả năng gây bệnh của G. tá tràng.Mục tiêu chung của chúng tôi là phát triển các mục tiêu đầy hứa hẹn để ngăn ngừa nhiễm trùng G. tá tràng.
Chuột cái C57BL / 6 loại hoang dã (WT) ở độ tuổi 5 tuổi8 tuần được mua từ Trung tâm Động vật Thực nghiệm Changsheng Liêu Ninh (Liêu Ninh, Trung Quốc).Chuột được tiếp cận với nước miễn phí, nhận thức ăn tiệt trùng và được giữ trong chu kỳ sáng/tối 12/12 giờ.Trước khi bị nhiễm bệnh, chuột được dùng kháng sinh ad libitum trong nước uống có bổ sung ampicillin (1 mg/mL), vancomycin (1 mg/mL) và neomycin (1,4 mg/mL) (tất cả đều mua từ Thượng Hải, Trung Quốc, sinh vật nhân tạo) [ 22 ].].Những con chuột mất khả năng ăn uống trong > 24 giờ và giảm ≥ 20% trọng lượng cơ thể đã được tiêu hủy nhân đạo do trật khớp cổ tử cung.
WB G. Duodenalis trophozoites (Bộ sưu tập văn hóa kiểu Mỹ, Manassas, Hoa Kỳ) được bổ sung 12,5% huyết thanh bào thai bò (FBS; Every Green, Chiết Giang, Trung Quốc) và 0,1% mật bò (Sigma-Aldrich, St. Missouri, Hoa Kỳ) ).USA) trong điều kiện vi hiếu khí.Các thể tư dưỡng hợp lưu được thu thập trên băng và được di chuyển theo tỷ lệ 1:4 để tái tạo thêm.
Nang tá tràng Giardia được tạo ra như mô tả trước đây [23], thể tư dưỡng được thu hoạch ở pha logarit và sau đó được pha loãng bằng môi trường tạo bao nang, pH 7.1 (TYI-S-33 đã sửa đổi) đến nồng độ cuối cùng là 1 × 106 thể tư dưỡng/mL.nồng độ mật trung bình 0,05%).Trophozoites được nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí ở 37°C cho đến giai đoạn tăng trưởng logarit.Thay đổi môi trường thành môi trường tạo nang (pH 7,8; ​​môi trường TYI-S-33 đã được sửa đổi với nồng độ mật 1%) và nuôi cấy G. tá tràng ở 37°C trong 48–96 giờ, trong đó các nang hình thành được quan sát dưới kính hiển vi.Sau khi hầu hết các thể tư dưỡng đã được tạo thành nang, hỗn hợp nuôi cấy được thu hoạch và hòa lại trong nước khử ion vô trùng để phân giải các thể tư dưỡng còn lại.Các u nang được đếm và bảo quản ở nhiệt độ 4°C để phân tích tiếp theo qua ống thông dạ dày ở chuột.
Các túi ngoại bào Giardia (GEV) đã được làm giàu như mô tả trước đây [13].Trophozoite trong giai đoạn tăng trưởng logarit được treo lại trong môi trường TYI-S-33 đã được sửa đổi được chuẩn bị bằng FBS đã cạn kiệt exosome (Công nghiệp sinh học, Beit-Haemek, Israel) đến nồng độ cuối cùng là 1 × 106 ký sinh trùng/mL và ủ trong 12 giờ.được phân lập khỏi dịch nổi nuôi cấy bằng cách ly tâm ở tốc độ 2000 g trong 10 phút, 10.000 g trong 45 phút và 100.000 g trong 60 phút.Kết tủa được hòa tan trong dung dịch muối đệm phốt phát (PBS), định lượng bằng bộ xét nghiệm protein BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) và được bảo quản ở -80° C. hoặc sử dụng trực tiếp để phân tích thêm.
Các đại thực bào phúc mạc nguyên phát của chuột đã được chuẩn bị như mô tả trước đây [24].Tóm lại, chuột (6-8 tuần tuổi) được tiêm (trong màng bụng [ip]) 2,5 ml môi trường thioglycol lỏng 2,98% Difco (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) và cho ăn 3-4 khẩu vị.Một huyền phù đại thực bào được thu thập từ khoang bụng của chuột sau khi gây chết êm dịu và ly tâm 3 lần ở tốc độ 1000 g trong 10 phút.Các tế bào thu hoạch được phát hiện bằng phương pháp tế bào học dòng chảy sử dụng chất đánh dấu CD11b cho đến khi độ tinh khiết của tế bào >98%, sau đó thêm vào các đĩa nuôi cấy tế bào 6 giếng (4,5 x 106 tế bào/giếng) và ủ với 10% FBS (Công nghiệp sinh học) ở 37°C.và 5% CO2.
RNA được chiết xuất từ ​​1 × 107 trophozoites trong 1 ml thuốc thử TRIzol (Vazyme, Nam Kinh, Trung Quốc), DNA bộ gen được chiết xuất từ ​​​​RNA G. Duodenalis tổng số bằng MonScript dsDNase (Monad, Vũ Hán, Trung Quốc) và DNA bổ sung (cDNA) đã được tổng hợp sử dụng MonScript RTIIII Super Mix (Monad) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Thông tin trình tự CDS cho gen G. tá tràng mục tiêu được lấy từ Ngân hàng gen NCBI.Sử dụng Primer 5.0 để thiết kế các đoạn mồi nhân bản liền mạch cụ thể cho từng gen mục tiêu.Đoạn mồi tiến (5′-3′) bao gồm ba phần: trình tự chồng lấp với vectơ tuyến tính pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) và các codon khởi đầu ATG và GNN (nếu cơ sở đầu tiên không phải là G).Điều này được thực hiện để cải thiện hiệu quả của biểu thức.Ngoài ra, ít nhất 16 bazơ kết hợp (hàm lượng GC 40–60%/Tm khoảng 55 °C).Đoạn mồi ngược (5′-3′) bao gồm hai phần, một trình tự chồng chéo với vectơ pcDNA3.1(+) được tuyến tính hóa EcoRV (GCCGCCACTGTGCTGGAT) và một bazơ kết hợp ít nhất 16 bp.(không bao gồm hai điểm dừng cuối cùng).bazơ) một codon như AA hoặc GA để cho phép các plasmid tái tổ hợp biểu hiện các protein được đánh dấu của chúng).Trình tự mồi được liệt kê trong Bảng 1 và được tổng hợp bởi Công ty TNHH Công nghệ sinh học Kangmet (Trường Xuân, Trung Quốc).
Các mục tiêu được khuếch đại bằng cách sử dụng Pfu DNA polymerase (Tiangen, Bắc Kinh, Trung Quốc) hoặc Ex-taq (Công ty TNHH Công nghệ y sinh Takara [Bắc Kinh], Bắc Kinh, Trung Quốc) bằng cách sử dụng cDNA G. Duodenalis đã chuẩn bị làm mẫu.Vectơ biểu hiện plasmid pcDNA3.1(+) của sinh vật nhân chuẩn được tuyến tính hóa bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV và được khử phospho bằng Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Các đoạn pcDNA3.1(+) được tuyến tính hóa và các đoạn gen mục tiêu khuếch đại đã được tinh chế bằng bộ tinh chế gel DNA (Tiangen) và định lượng bằng Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Đoạn pcDNA3.1(+) và từng đoạn gen mục tiêu được kết hợp lại bằng cách sử dụng hỗn hợp nhân bản lắp ráp đơn MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Tô Châu, Trung Quốc) và được xác nhận bằng trình tự DNA bằng cách sử dụng Comate Bioscience Company Limited (Trường Xuân, Trung Quốc) ..
Các plasmid không chứa nội độc tố pcDNA3.1(+)-alpha-2 và pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 được tạo ra bằng cách sử dụng Plasmid Mini Kit không chứa nội độc tố SanPrep (Sangon Biotech).Nồng độ được duy trì trên 500 ng/µl để đảm bảo rằng EDTA trong dung dịch đệm rửa giải không ảnh hưởng đến xét nghiệm chuyển nhiễm.Các đại thực bào phúc mạc nguyên phát của chuột được nuôi cấy trong các đĩa 6 giếng với môi trường RPMI 1640 hoàn chỉnh (Công nghiệp sinh học) trong 12 giờ, sau đó các tế bào được rửa 3 lần trong PBS ấm để loại bỏ penicillin và streptomycin, sau đó trong môi trường được bổ sung môi trường hoàn chỉnh.Các plasmid không chứa nội độc tố pcDNA3.1(+)-alpha-2 và pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 μg) đã được pha loãng trong 125 μl môi trường huyết thanh khử Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Sau đó, 5 µl thuốc thử chuyển hóa Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) được pha loãng trong 125 µl môi trường Opti-MEM huyết thanh thấp.Chuẩn bị phức hợp liposome-DNA bằng cách trộn plasmid không chứa nội độc tố đã pha loãng với Lipofectamine 2000 và để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.Chuyển riêng các phức chất vào các tế bào trong từng giếng và trộn từ từ.Sau 4 giờ, môi trường nuôi cấy tế bào được thay thế bằng 2 ml môi trường RPMI 1640 hoàn chỉnh và tiếp tục nuôi cấy trong 24 giờ.Môi trường nuôi cấy tế bào tươi được thêm vào tế bào và được ủ trong các thời điểm khác nhau tùy thuộc vào thiết kế xét nghiệm.
Các mẫu protein từ chất nổi trên bề mặt và dung dịch ly giải tế bào đã được chuẩn bị như mô tả trước đây [25].Các thông số truyền màng cho pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3,-actin và His-tag là 200 mA/90 phút.Đối với interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Switzerland) và NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Switzerland) và nhắm mục tiêu 1:5000 vào thẻ His ( Amylet Scientific, Vũ Hán, Trung Quốc) và β-actin (Proteintech, Vũ Hán, Trung Quốc).
Liên kết ngang với disuccinimide suberate (DSS) đã được thực hiện như mô tả trước đây [26].Các tế bào được rửa 3 lần bằng PBS lạnh và được ly giải hoàn toàn bằng kim cỡ 27 trong dung dịch đệm phản ứng ASC 50 µl (pH 8,0) chứa 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES và 125 mM NaHCO3.Hỗn hợp này được ly tâm ở mức 5000 g trong 3 phút và viên được khâu bằng 10 µl DSS (25 mM trong DMSO) và 40 µl dung dịch đệm phản ứng ASC trong 30 phút ở 37°C.Sau khi ly tâm ở tốc độ 5000 g trong 10 phút, viên được hòa tan trong dung dịch 40 µl dung dịch đệm phản ứng ASC và 10 µl dung dịch đệm nạp protein 6x (TransGen, Bắc Kinh, Trung Quốc), sau đó dung dịch được làm nguội ở nhiệt độ phòng trong 15 phút., Sau đó đun sôi 10 phút.Các mẫu protein sau đó được làm mờ bằng phương pháp phương Tây bằng cách sử dụng kháng thể chống ASC chính (Wanleibio, Thẩm Dương, Trung Quốc) với tỷ lệ pha loãng 1:500.
Theo quy trình được mô tả trước đây [13], chất nổi trên bề mặt nuôi cấy tế bào đã được thu hoạch và sự bài tiết cytokine IL-1β gây viêm được xác định bằng cách sử dụng bộ ELISA IL-1 Beta của chuột (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Chuyển đổi giá trị OD450nm thành nồng độ protein bằng đường chuẩn IL-1β.
Các tế bào được phủ trên lá kính phủ được rửa nhẹ nhàng 3 lần trong PBS ấm, cố định trong chất cố định tế bào mô (Biosharp, Bắc Kinh, Trung Quốc) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng (RT), trong Triton X-Permeabilize 0,1% ở 100 (pha loãng trong PBS; Biosharp ) trong 20 phút ở nhiệt độ phòng và chặn albumin huyết thanh bò 5% (trong PBS) trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng.Sau đó, các tế bào được ủ qua đêm ở 4°C với các kháng thể chính chống lại ASC (độ pha loãng 1:100) hoặc NLRP3 (độ pha loãng 1:100), và kháng thể kháng thỏ được dán nhãn Cy3 là IgG(H+L) (1:400; EarthOx). , San Francisco, CA, USA) hoặc IgG kháng chuột của dê kết hợp FITC (1:400; Earthox) qua đêm ở 37°C trong bóng tối trong 1 giờ.Các hạt nhân được nhuộm bằng Hoechst 33258 (10 g / ml; UE, Tô Châu, Trung Quốc) trong 5 phút và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (Tập đoàn Olympus, Tokyo, Nhật Bản).
Chuột được chia thành bốn nhóm (n = 7 trong mỗi nhóm): (i) Nhóm đối chứng âm tính được điều trị bằng PBS (chỉ PBS; cho 100 µl/chuột PBS vào ống, sau đó tiêm trong màng bụng hàng ngày 100 µl/chuột PBS 3 giờ sau)., liên tục trong 7 ngày);(ii) nhóm đối chứng âm tính được điều trị bằng chất ức chế MCC950 [27] (100 µl/con chuột qua ống PBS, 3 giờ sau, 10 mg/kg trọng lượng cơ thể [BW] MCC950 [trong PBS] được tiêm trong màng bụng hàng ngày, thời gian 7 ngày);(iii) Nhóm nhiễm nang G. tá tràng (1,5 x 106 nang/chuột bằng ống thông, 3 giờ sau, 100 μl/chuột PBS tiêm trong màng bụng hàng ngày trong 7 ngày);(iv) Nhóm nhiễm trùng kết hợp u nang G. tá tràng Nhóm điều trị bằng chất ức chế MCC950 (1,5×106 nang/chuột qua ống thông, 10mg/kg trọng lượng cơ thể MCC950 tiêm trong màng bụng hàng ngày trong 7 ngày lúc 3 giờ).Trọng lượng cơ thể của mỗi con chuột được theo dõi hàng ngày và tất cả những con chuột đều được tiêu hủy vào ngày thứ 7.Tá tràng thu hoạch (dài 3 cm) được cắt thành từng miếng nhỏ trong 1 ml PBS, bào xác được tiêu hủy qua đêm trong PBS ở nhiệt độ 4°C, và vi khuẩn G.duodenalis trophozoites.Tá tràng tươi (dài 1 cm) được phân lập để nhuộm hematoxylin và eosin (H&E).
Chuột được chia thành hai nhóm: (i) nhóm kiểm soát MOCK và (ii) nhóm ức chế MCC950.Có năm phương pháp điều trị trong mỗi nhóm (n = 7/nhóm điều trị): (i) Nhóm đối chứng âm tính với điều trị PBS (chỉ PBS; 100 µl/chuột PBS, tiêm bắp (IM) (xương chày trước) [28, 29];( ii) nhóm đối chứng âm tính với plasmid pcDNA3.1(+) (100 µg/DNA của chuột, qua tiêm bắp); (iii) nhóm đối chứng dương tính với nhiễm nang G. tá tràng (1,5 x 106 nang/chuột, qua ống thông) (iv) a nhóm được điều trị bằng plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/DNA của chuột, bằng cách tiêm bắp) và (v) một nhóm được điều trị bằng plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg/con chuột) DNA, sau 12 giờ di chuyển, những con chuột trong nhóm ức chế MCC950 được tiêm MCC950 trong phúc mạc hàng ngày (10 mg/kg trọng lượng cơ thể) trong 7 ngày, trong khi những con chuột trong nhóm MOCK nhận được một lượng điều trị PBS tương đương. Các mẫu máu được được thu thập từ chuột có nhãn cầu và để qua đêm ở nhiệt độ 4°C. Các mẫu huyết thanh được phân lập bằng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) và đo nồng độ IL-1β.
Ba mươi lăm con chuột được chia thành năm nhóm (n=7/nhóm).Nhóm 1 là nhóm đối chứng âm tính được điều trị bằng PBS: chuột được tiêm bắp 100 µl PBS và 3 ngày sau bằng ống thông.Nhóm 2 là nhóm đối chứng dương tính bị nhiễm nang G. tá tràng: chuột được tiêm 100 μl PBS và 3 ngày sau 1,5 x 106 nang/chuột được tiêm vào dạ dày.Nhóm thứ ba – miễn dịch plasmid bằng pcDNA3.1(+) kết hợp với nhóm đối chứng nhiễm trùng u nang tá tràng: chuột nhận được 100 μg DNA plasmid pcDNA3.1(+)(im) bằng đường uống, 1,5 × 106 nang/chuột 3 cho một vài con ngày.Nhóm 4 và 5 là plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine tái tổ hợp hoặc pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine plasmid kết hợp với nhiễm trùng nang G. tá tràng.Nhóm thử nghiệm: chuột nhận được 100 µg pcDNA3.DNA plasmid 1(+)-giardine (im), sau đó 3 ngày, 1,5 × 106 nang/chuột được tiêm qua ống thông.Trọng lượng cơ thể của mỗi con chuột được theo dõi sau khi đưa nang G. tá tràng qua ống.Tá tràng tươi được thu thập để đo lượng ký sinh trùng và phân tích nhuộm HE.
Những thay đổi mô bệnh học được phân tích theo quy trình đã được công bố trước đó [30].Tá tràng tươi được cố định bằng chất cố định tế bào mô, nhúng vào parafin, cắt thành các đoạn 4 μm, nhuộm H&E và phân tích dưới kính hiển vi ánh sáng.Những thay đổi bệnh lý điển hình ở bảy phần mô từ bảy con chuột độc lập được đánh giá bởi một nhà nghiên cứu bệnh học không biết về phương pháp điều trị và được ghi lại ở độ phóng đại 200 lần.Chiều dài của lông nhung và độ sâu của các hốc được đo theo các phương pháp được mô tả trước đó.
Các kết quả in vitro và in vivo thu được ba lần.Đồ thị được tạo bằng GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Sự khác biệt giữa hai nhóm được phân tích bằng t-test, trong khi sự khác biệt giữa ≥3 nhóm được phân tích bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) bằng phần mềm SPSS (phiên bản 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Dữ liệu được phân tích về tính đồng nhất của phương sai bằng cách sử dụng thử nghiệm của Levene, sau đó là thử nghiệm hậu kiểm của Bonferroni (B).Ý nghĩa được biểu thị bằng P<0,05, P<0,01 và P<0,001 (không đáng kể [ns]) (P>0,05).
Phân tích trước đây của chúng tôi về GEV proteomics trong Bách khoa toàn thư về gen và bộ gen ở Kyoto (KEGG) cho thấy nhiều mục tiêu có thể liên quan đến việc kích hoạt các con đường truyền tín hiệu viêm [13].Chúng tôi đã chọn hai mục tiêu đầy hứa hẹn, alpha-2 và alpha-7.3 giardin, khuếch đại các phân tử này và sử dụng chúng để xây dựng vectơ biểu hiện sinh vật nhân chuẩn pcDNA3.1(+).Sau khi giải trình tự, các plasmid biểu hiện pcDNA3.1(+)-alpha-2 và alpha-7.3 giardine tái tổ hợp đã được chuyển vào các đại thực bào phúc mạc nguyên phát của chuột và protein đặc trưng của caspase-1 p20 của chứng viêm (một đoạn caspase-1 được kích hoạt) đã được xác định. như làm sáng tỏ các phân tử quan trọng có thể gây viêm.Kết quả cho thấy giardine alpha-2 và alpha-7.3 có thể tạo ra biểu hiện p20 caspase-1 tương tự GEV.Không tìm thấy ảnh hưởng nào đến việc kích hoạt caspase-1 ở đối chứng âm tính chưa được xử lý (chỉ PBS) và kiểm soát plasmid pcDNA3.1(+) (Hình 1).
Đo kích hoạt p20 caspase-1 bằng pcDNA3.1(+)-alpha-2 và alpha-7.3 giardin.Các plasmid biểu hiện sinh vật nhân chuẩn tái tổ hợp pcDNA3.1(+)-alpha-2 và alpha-7.3 giardines (phía trên mỗi làn) được chuyển vào các đại thực bào phúc mạc nguyên phát của chuột và các chất nổi trên bề mặt nuôi cấy được thu hoạch 24 giờ sau đó.Phương pháp làm mờ phương Tây đã được sử dụng để đo mức độ biểu hiện của protein hồng cầu caspase-1 p20 đặc trưng.Nhóm điều trị chỉ có PBS (làn C) và nhóm đơn trị liệu pcDNA3.1(+) (làn pcDNA3.1) được sử dụng làm đối chứng âm tính và nhóm điều trị GEV được sử dụng làm đối chứng dương tính.Sự biểu hiện của protein tái tổ hợp đã được xác nhận bằng cách phát hiện thẻ histidine trong mỗi protein và các dải protein dự kiến ​​là alpha-2 giardine (38,2 kDa) và alpha-7,3 giardine (37,2 kDa).GEV, túi ngoại bào Giardia tá tràng, pcDNA3.1(+), vectơ tuyến tính hóa EcoRV, SUP, chất nổi trên bề mặt
Để xác định xem alpha-2 giardine và alpha-7.3 giardine có gây ra biểu hiện p20 caspase-1 hay không và đóng vai trò kích hoạt phản ứng viêm NLRP3 của vật chủ, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine và pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardin đã được chuyển vào các đại thực bào phúc mạc nguyên phát của chuột bằng DNA plasmid tái tổ hợp và mức độ biểu hiện, định vị và oligome hóa của các protein gây viêm quan trọng NLRP3 đã được xác định.Trong thí nghiệm này, GEV được sử dụng làm nhóm đối chứng dương và nhóm không điều trị (chỉ PBS) hoặc nhóm điều trị chuyển nhiễm pcDNA3.1(+) là nhóm âm tính.Kết quả cho thấy, giống như nhóm GEV, DNA plasmid tái tổ hợp của giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 và giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 dẫn đến sự điều hòa ngược của NLRP3, pro-IL-1β và Kích hoạt Procaspase-1 và caspase-1 (Hình 2a).Ngoài ra, cả hai loại giardine đều gây ra sự tiết IL-1β đáng kể (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Hình 2b).Hầu hết các protein ASC là dạng đơn phân trong nhóm không điều trị hoặc trong nhóm điều trị được truyền plasmid pcDNA3.1(+), trái ngược với pcDNA3.1(+)-alpha-2 hoặc pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 giarđin.Quá trình oligome hóa ASC xảy ra trong DNA plasmid tái tổ hợp của nhóm hoặc nhóm đối chứng dương tính GEV, cho thấy dạng oligomeric (Hình 2c).Những dữ liệu sơ bộ này cho thấy rằng giardine alpha-2 và giardine alpha-7,3 có thể gây ra kích hoạt viêm NLRP3.Các nghiên cứu huỳnh quang miễn dịch sau đó về việc định vị ASC và NLRP3 cho thấy rằng ở nhóm đối chứng âm tính, protein ASC nằm rải rác khắp tế bào chất và xuất hiện dưới dạng tín hiệu chấm khi kích thích pcDNA3.1(+)-alpha-2 với giardine hoặc pcDNA3.Nhóm 1(+)-alpha-7,3 giardine hoặc nhóm kiểm soát GEV dương tính (Hình 2d).Trong nhóm pcDNA 3.1 đối chứng âm và được xử lý bằng plasmid, tín hiệu protein NLRP3 không được phát hiện, trong khi dấu chấm tín hiệu huỳnh quang phản ứng với pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine hoặc pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 đã được phát hiện..giardine được tìm thấy trong tế bào chất hoặc khi có sự kích thích của HEV (Hình 2e).Những dữ liệu này chứng minh thêm rằng G. Duodenalis giardin alpha-2 và giardin alpha-7.3 kích hoạt dòng siêu nhỏ NLRP3 trong đại thực bào phúc mạc nguyên phát ở chuột.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin và pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin kích hoạt dòng hồng cầu NLRP3 trong đại thực bào phúc mạc chuột.Truyền các plasmid biểu hiện sinh vật nhân chuẩn tái tổ hợp pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin và pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin vào các tế bào và đại thực bào phúc mạc nguyên phát ở chuột, hoặc thu hoạch phần nổi phía trên trong vòng 24 giờ để phân tích biểu hiện, oligome hóa , bài tiết.và định vị các protein gây viêm quan trọng.Nhóm chỉ có PBS (C) và nhóm điều trị đơn lẻ pcDNA3.1(+) được sử dụng làm đối chứng âm tính và nhóm điều trị GEV được sử dụng làm nhóm dương tính.a Các protein gây viêm chính NLRP3, bao gồm NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 và p20 caspase-1, đã được phát hiện bằng phương pháp làm mờ phương Tây.b Mức độ bài tiết IL-1β trong chất nổi phía trên được xác định bằng cách sử dụng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA).Sự khác biệt giữa nhóm đối chứng và nhóm thực nghiệm được phân tích bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) bằng phần mềm SPSS phiên bản 22.0.Dấu hoa thị cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm ** P <0, 01 và *** P <0, 001.c Mức độ oligome hóa ASC trong các viên được xác định bằng phân tích liên kết ngang DSS, trong khi mức ASC trong dung dịch ly giải tế bào được sử dụng làm chất kiểm soát tải.d Trực quan hóa nội địa hóa ISC bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang.e Miễn dịch huỳnh quang đã được sử dụng để trực quan hóa quá trình bản địa hóa của NLRP3.ASC, protein giống đốm apoptotic;IL, interleukin;NLRP3, thụ thể giống như oligome hóa liên kết với nucleotide 3;ns, không đáng kể (P > 0,05)
Cả G. tá tràng và GEV mà nó tiết ra đều kích hoạt dòng hồng cầu NLRP3 và điều chỉnh phản ứng viêm của vật chủ trong ống nghiệm.Vì vậy, vai trò của dòng siêu nhỏ NLRP3 trong khả năng gây bệnh của G. tá tràng vẫn chưa rõ ràng.Để điều tra vấn đề này, chúng tôi đã thiết kế một thí nghiệm giữa những con chuột bị nhiễm u nang G. tá tràng và những con chuột bị nhiễm u nang G. tá tràng + điều trị bằng thuốc ức chế MCC950 và so sánh biểu hiện hồng cầu NLRP3 khi bị nhiễm u nang G. tá tràng.Sơ đồ chi tiết của thí nghiệm được hiển thị trong Hình 3a.Sự thay đổi trọng lượng cơ thể của chuột ở các nhóm điều trị khác nhau được theo dõi trong 7 ngày sau khi bị nhiễm u nang và kết quả được thể hiện trong Hình 3b.So với nhóm được điều trị bằng PBS nguyên chất, kết quả cho thấy (i) trọng lượng cơ thể của chuột nhiễm nang G. tá tràng giảm từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7 sau khi nhiễm bệnh;(ii) điều trị bằng chất ức chế MCC950 không có ảnh hưởng đáng kể đến trọng lượng cơ thể của chuột..So với nhóm nhiễm đơn lẻ, thể trọng của nhóm nhiễm trùng tá tràng được điều trị bằng MCC950 giảm ở các mức độ khác nhau (Ngày 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Ngày 2: ANOVA, F(3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001; Ngày 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; Ngày 4: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052; (3, 24)=0,6497, P=0,0645; Ngày 6: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175; Ngày 7: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Những dữ liệu này chứng minh rằng dòng siêu nhỏ NLRP3 bảo vệ chuột khỏi bị giảm cân đáng kể trong giai đoạn đầu (2-4 ngày) của nhiễm trùng tá tràng.Sau đó, chúng tôi nhằm mục đích phát hiện trophozoites G. tá tràng trong dịch rửa tá tràng và kết quả được thể hiện trong Hình 3c.So với nhóm nhiễm u nang G. tá tràng, số lượng thể tư dưỡng trong tá tràng tăng lên đáng kể sau khi ngăn chặn dòng hồng cầu NLRP3 (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Các mô tá tràng được nhuộm bằng HE cho thấy, so với đối chứng âm tính được điều trị bằng PBS và MCC950: ​​(i) Nhiễm nang G. tá tràng dẫn đến tổn thương nhung mao tá tràng (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P= 0,0488 ) và teo mật mã (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) tá tràng từ chuột bị nhiễm nang G. tá tràng và được điều trị bằng thuốc ức chế MCC950.nhung mao tá tràng bị tổn thương và chết (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) bị teo và phân nhánh mật mã (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Hình 3d- f) .Những kết quả này cho thấy dòng siêu nhỏ NLRP3 đóng vai trò làm giảm khả năng gây bệnh của G. tá tràng.
Vai trò của hồng cầu NLRP3 trong nhiễm trùng Giardia tá tràng.Chuột được tiêm (iv) u nang tá tràng và sau đó được điều trị có hoặc không có MCC950 (ip).Các nhóm điều trị đơn lẻ với PBS hoặc MCC950 được sử dụng làm đối chứng.Nhóm thực nghiệm và phác đồ điều trị.b Trọng lượng cơ thể của chuột ở mỗi nhóm điều trị khác nhau được theo dõi trong 7 ngày.Sự khác biệt giữa nhóm nhiễm G. tá tràng và nhóm điều trị nhiễm G. tá tràng + MCC950 được phân tích bằng t-test bằng phần mềm SPSS phiên bản 22.0.Dấu hoa thị biểu thị sự khác biệt đáng kể ở mức *P<0,05, **P<0,01 hoặc ***P<0,001.c Tải lượng ký sinh trùng được xác định bằng cách đếm số lượng tư dưỡng trong dịch rửa tá tràng.Sự khác biệt giữa nhóm nhiễm G. tá tràng và nhóm điều trị nhiễm G. tá tràng + MCC950 được phân tích bằng t-test bằng phần mềm SPSS phiên bản 22.0.Dấu hoa thị cho thấy sự khác biệt đáng kể ở mức * P < 0,05.d Kết quả nhuộm Hematoxylin và eosin (H&E) của mô bệnh học tá tràng.Mũi tên màu đỏ biểu thị thiệt hại cho nhung mao, mũi tên màu xanh lá cây biểu thị thiệt hại cho các hầm mộ.Thanh tỷ lệ: 100 µm.e, f Phân tích thống kê chiều cao lông nhung tá tràng và chiều cao hốc chuột.Dấu hoa thị biểu thị sự khác biệt đáng kể ở mức *P<0,05 và **P<0,01.Kết quả được lấy từ 7 thí nghiệm sinh học độc lập.BW, trọng lượng cơ thể;ig, đường giao hàng trong dạ dày;ip, đường sinh trong phúc mạc;ns, không đáng kể (P > 0,05);PBS, dung dịch muối đệm phốt phát;WT, loại hoang dã
Sự tiết IL-1β là dấu hiệu đặc trưng của quá trình kích hoạt viêm.Để xác định xem G. Duodenalis alpha-2 giardine và alpha-7.3 giardine có kích hoạt inflammasome của vật chủ NLRP3 hay không, chúng tôi đã sử dụng chuột WT chưa được điều trị (nhóm giả) và chuột bị chặn hồng cầu NLRP3 (nhóm điều trị bị ức chế MCC950).Sơ đồ chi tiết của thí nghiệm được hiển thị trong Hình 4a.Các nhóm thử nghiệm bao gồm những con chuột được điều trị bằng PBS, điều trị u nang G. tá tràng bằng ống thông, tiêm bắp pcDNA3.1 và tiêm bắp pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine hoặc pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.Vào ngày thứ 7 sau khi tiêm bắp plasmid tái tổ hợp, huyết thanh đã được thu thập và mức IL-1β trong mỗi nhóm được xác định.Như được hiển thị trong Hình 4b, trong nhóm MOCK: (i) so với nhóm PBS, việc điều trị bằng pcDNA3.1 không có tác dụng đáng kể đối với sự bài tiết IL-1β (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), tuy nhiên, Sự tiết IL-β tăng đáng kể ở nhóm u nang G. tá tràng (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine và pcDNA3.1- Tiêm bắp alpha-7.3 giardine làm tăng đáng kể nồng độ IL-1β huyết thanh (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine gây ra mức độ tiết IL -1β cao trong nhóm tiêm bắp pcDNA3.1-alpha-2 (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .So với từng nhóm trong nhóm điều trị MCC950 và nhóm MOCK: (i) Mức độ bài tiết IL-1β ở nhóm đối chứng PBS và nhóm đối chứng pcDNA3.1 giảm ở một mức độ nhất định sau khi ngăn chặn chất ức chế MCC950, nhưng sự khác biệt là không đáng kể (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) sau khi chặn MCC950., sự bài tiết IL-1β đã giảm đáng kể ở nhóm nhiễm u nang G. tá tràng, nhóm giardine pcDNA3.1-alpha-2 và nhóm giardine pcDNA3.1-alpha-7.3 (G. tá tràng: ANOVA, F(9 , 58) = 3,540, P = 0,0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(9, 58) ) = 3,540, P = 0,0164).Những kết quả này cho thấy rằng alpha-2 giardine và alpha-7.3 giardine làm trung gian cho việc kích hoạt dòng siêu nhỏ NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardines kích hoạt tế bào chủ NLRP3 in vivo.Chuột đã được tiêm chủng (IM) bằng plasmid biểu hiện nhân chuẩn tái tổ hợp pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine hoặc pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine và sau đó được điều trị bằng MCC950 (ip; nhóm MCC950) hoặc không (nhóm giả) ).Nhóm điều trị bằng plasmid PBS hoặc pcDNA3.1(+) được sử dụng làm đối chứng âm tính, nhóm điều trị u nang G. tá tràng được sử dụng làm đối chứng dương tính.Nhóm thực nghiệm và phác đồ điều trị.b Nồng độ IL-1β trong huyết thanh ở chuột được đo vào ngày thứ 7 bằng xét nghiệm ELISA.Sự khác biệt giữa các nhóm trong nhóm MOCK được phân tích bằng ANOVA một chiều và sự khác biệt giữa nhóm MOCK và nhóm MCC950 được phân tích bằng t-test của phần mềm SPSS phiên bản 22.0.Dấu hoa thị cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm điều trị trong nhóm MOCK, *P<0,05 và ***P<0,001;ký hiệu đô la ($) biểu thị sự khác biệt đáng kể giữa mỗi nhóm trong nhóm MOCK và nhóm MCC950 với P <0,05.Kết quả của bảy thí nghiệm sinh học độc lập.i, tiêm bắp, ns, không đáng kể (P > 0,05)
Để nghiên cứu ảnh hưởng của việc kích hoạt qua trung gian alpha-2 và alpha-7.3 giardine của thể siêu nhỏ của vật chủ NLRP3 đối với khả năng lây nhiễm của G. tá tràng, chúng tôi đã sử dụng chuột WT C57BL/6 và tiêm alpha-2 giardine và alpha-7.3 giardine.plasmid được tiêm bắp, sau 3 ngày qua ống dạ dày của u nang G. tá tràng, sau đó quan sát chuột trong 7 ngày.Sơ đồ chi tiết của thí nghiệm được hiển thị trong Hình 5a.Trọng lượng cơ thể của mỗi con chuột được đo hàng ngày, các mẫu mô tá tràng tươi được thu thập vào ngày thứ 7 sau khi dùng qua ống thông dạ dày, số lượng thể tư dưỡng được đo và những thay đổi về mô bệnh học được quan sát.Như được hiển thị trong Hình 5b, khi thời gian cho ăn tăng lên, trọng lượng cơ thể của chuột trong mỗi nhóm tăng dần.MT của chuột bắt đầu giảm vào ngày thứ 3 sau khi tiêm nang G. tá tràng vào dạ dày, sau đó tăng dần.Kích hoạt dòng siêu nhỏ NLRP3 gây ra bằng cách tiêm bắp alpha-2 giardine và alpha7.3 giardine làm giảm đáng kể việc giảm cân ở chuột (Ngày 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0,9754 Ngày 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 Ngày 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; Ngày 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409; Ngày 3: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Ngày 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083 Ngày 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Ngày 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, Ngày 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Ngày 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Ngày 6: pcDNA3 .1 - alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Ngày 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Ngày 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Ngày 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0,5369, P <0,0001).Tải lượng ký sinh trùng được đánh giá ở tá tràng (Hình 5c).So với nhóm đối chứng dương tính không được điều trị và nhóm được tiêm vectơ pcDNA3.1 trống, số lượng thể tư dưỡng G. Duodenalis đã giảm đáng kể ở các nhóm được tiêm α-2 giardine và α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha). -2 giarđin : ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giarđin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Ngoài ra, giardine alfa-7.3 có tác dụng bảo vệ ở chuột tốt hơn giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Kết quả nhuộm HE được thể hiện trong hình.5d–f.Những con chuột được tiêm alpha-2 giardine và alpha-7.3 giardine có ít tổn thương mô tá tràng hơn, biểu hiện bằng tổn thương lông nhung, so với những con chuột được tiêm G. tá tràng và những con chuột được tiêm G. tá tràng kết hợp với một vec tơ pcDNA3 trống .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 hoặc P = 0,0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 hoặc P = 0,0055) và giảm teo mật mã (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 hoặc P = 0,0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 hoặc P = 0,0191).Những kết quả này cho thấy rằng alpha-2 giardine và alpha-7,3 giardine làm giảm khả năng lây nhiễm của G. tá tràng bằng cách kích hoạt dòng hồng cầu NLRP3 in vivo.
Vai trò của pcDNA3.1(+)-giardin trong nhiễm trùng G. tá tràng.Chuột đã được tiêm chủng (IM) với các plasmid biểu hiện nhân thực tái tổ hợp pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine hoặc pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine và sau đó thử thách với nang G. tá tràng (ig).Nhóm PBS và nhóm điều trị u nang tá tràng pcDNA3.1(+) + được sử dụng làm nhóm đối chứng âm tính và nhóm điều trị u nang tá tràng được sử dụng làm nhóm đối chứng dương tính.Nhóm thực nghiệm và phác đồ điều trị.b MT của chuột ở mỗi nhóm điều trị khác nhau được theo dõi trong 7 ngày sau thử thách.Dấu hoa thị cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm trong nhóm G. tá tràng và nhóm giardine pcDNA3.1(+)-alpha-2, *P < 0,05, **P < 0,01 và ***P < 0,001;ký hiệu đô la ($) biểu thị sự khác biệt đáng kể giữa mỗi nhóm G. tá tràng và nhóm jardine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3, $$P<0,01 và $$$P<0,001.c Tải lượng ký sinh trùng được xác định bằng cách đếm số lượng ký sinh trùng trong 1 ml dịch rửa tá tràng từ tá tràng (dài 3 cm) và được biểu thị bằng số lượng ký sinh trùng trên mỗi cm tá tràng.Sự khác biệt giữa nhóm nhiễm G. Duodenalis, nhóm giardine pcDNA3.1(+)-alpha-2 và nhóm giardine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 được phân tích bằng ANOVA một chiều bằng phần mềm SPSS phiên bản 22.0.Dấu hoa thị biểu thị sự khác biệt đáng kể ở ** P<0,01 và *** P <0,001.d Thay đổi mô bệnh học ở tá tràng.Mũi tên màu đỏ biểu thị thiệt hại cho nhung mao, mũi tên màu xanh lá cây biểu thị thiệt hại cho các hầm mộ.Thanh tỷ lệ: 100 µm.e, f Phân tích thống kê về chiều cao lông nhung tá tràng của chuột ( e ) và chiều cao mật mã ( f ).Sự khác biệt giữa các nhóm trong Hình 1d được phân tích bằng ANOVA một chiều bằng phần mềm SPSS phiên bản 22.0.Dấu hoa thị biểu thị sự khác biệt đáng kể ở mức *P<0,05 và **P<0,01.Kết quả của bảy thí nghiệm sinh học độc lập.ns, không đáng kể (P > 0,05)
Giardia tá tràng là một loại ký sinh trùng đường ruột nổi tiếng ở người và các động vật có vú khác gây ra bệnh giardia.Năm 2004, nó được đưa vào Sáng kiến ​​về các bệnh bị bỏ quên của WHO do tỷ lệ lưu hành cao trong 6 năm, đặc biệt là ở các cộng đồng có tình trạng kinh tế xã hội thấp [32].Hệ thống miễn dịch bẩm sinh đóng một vai trò quan trọng trong phản ứng miễn dịch đối với nhiễm trùng G. tá tràng.Các đại thực bào chuột đã được báo cáo là có khả năng nhấn chìm và tiêu diệt G. tá tràng bằng cách giải phóng các bẫy ngoại bào [33].Các nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã chỉ ra rằng G. tá tràng, một loại ký sinh trùng ngoại bào không xâm lấn, kích hoạt các con đường truyền tín hiệu viêm p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 và NLRP3 trong đại thực bào chuột để điều chỉnh phản ứng viêm của vật chủ và giải phóng GEV có thể tăng cường quá trình này.13], 24].Tuy nhiên, các PAMP chính xác liên quan đến tình trạng viêm do hồng cầu NLRP3 điều chỉnh trong GEV và vai trò của hồng cầu NLRP3 trong bệnh giardia vẫn chưa được làm rõ.Để làm sáng tỏ hai câu hỏi này, chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu này.
Dòng siêu nhỏ NLRP3 nằm trong tế bào chất của tế bào miễn dịch và có thể được kích hoạt bởi nhiều hạt khác nhau như tinh thể axit uric, chất độc, vi khuẩn, vi rút và ký sinh trùng.Trong các nghiên cứu về vi khuẩn, chất độc đã được xác định là PAMP chính kích hoạt các cảm biến viêm, dẫn đến viêm và chết tế bào [34].Một số độc tố có cấu trúc đa dạng, chẳng hạn như hemolysin từ Staphylococcus aureus [35] và Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) từ enterotoxin (NHE) [37], gây ra sự kích hoạt viêm NLRP3.Các nghiên cứu về virus đã chỉ ra rằng các protein có độc lực như protein vỏ (E) của SARS-COV-2 [38] và protein NS5 của virus sốt rét [39] là những PAMP quan trọng được thụ thể NLRP3 công nhận.Trong các nghiên cứu về ký sinh trùng, nhiều loại ký sinh trùng đã được báo cáo là có liên quan đến hoạt hóa hồng cầu của vật chủ, chẳng hạn như Toxoplasma gondii, Trichomonas vagis [40], Trypanosoma cruzi [41] và Leishmania [42].Các protein dạng hạt dày đặc GRA35, GRA42 và GRA43, có liên quan đến độc lực của Toxoplasma gondii, cần thiết để gây ra hiện tượng pyroptosis trong đại thực bào chuột Lewis [43].Ngoài ra, một số nghiên cứu về Leishmania đã tập trung vào các phân tử riêng lẻ liên quan đến dòng siêu nhỏ NLRP3, chẳng hạn như lipophosphoglycan màng ký sinh trùng [44] hoặc kẽm metallicoprotease [45].Trong số họ gen alpha-giardin giống phụ lục, giardin alpha-1 đã được chứng minh là một ứng cử viên vắc xin tiềm năng cung cấp khả năng bảo vệ chống lại G. Duodenalis trên mô hình chuột [18].Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi đã chọn các yếu tố độc lực của G. tá tràng alpha-2 và alpha-7,3 giardines, những yếu tố độc nhất của giardia nhưng tương đối ít được báo cáo.Hai gen mục tiêu này đã được sao chép vào vectơ hệ thống biểu hiện nhân chuẩn pcDNA3.1(+) để phân tích quá trình kích hoạt phản ứng viêm.
Trong mô hình chuột của chúng tôi, các mảnh caspase bị cắt đóng vai trò là dấu hiệu kích hoạt viêm.Sau khi được kích thích, NLRP3 tương tác với ASC, tuyển dụng các Procaspase và tạo ra các tầng hoạt động tách pro-IL-1β và pro-IL-18 thành IL-1β và IL-18 trưởng thành, tương ứng -18.Caspase viêm (caspase-1, -4, -5 và -11) là một họ cysteine ​​​​protease được bảo tồn, rất quan trọng cho khả năng phòng vệ bẩm sinh và có liên quan đến tình trạng viêm và chết tế bào theo chương trình [46].Caspase-1 được kích hoạt bởi các dòng siêu nhỏ [47], trong khi caspase-4, -5 và -11 bị phân cắt trong quá trình hình thành các dòng siêu nhỏ không điển hình [48].Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng đại thực bào phúc mạc của chuột làm mô hình và nghiên cứu p20 caspase-1 đã phân tách caspase-1 như một dấu hiệu cho thấy sự kích hoạt viêm NLRP3 của vật chủ trong các nghiên cứu về nhiễm trùng G. tá tràng.Kết quả cho thấy nhiều alpha-giardin chịu trách nhiệm kích hoạt tình trạng viêm điển hình, điều này phù hợp với việc phát hiện ra các phân tử độc lực quan trọng liên quan đến vi khuẩn và vi rút.Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi chỉ là sàng lọc sơ bộ và có những phân tử khác có thể kích hoạt các thể siêu vi phi cổ điển, vì nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã tìm thấy cả các thể siêu nhỏ cổ điển và phi cổ điển trong nhiễm trùng G. tá tràng [13].Để xác định thêm liệu p20 caspase-1 được tạo ra có liên quan đến dòng hồng cầu NLRP3 hay không, chúng tôi đã chuyển giardin alpha-2 và alpha-7.3 vào đại thực bào phúc mạc của chuột để xác định mức độ biểu hiện protein phân tử quan trọng và mức độ oligome hóa ASC, xác nhận rằng cả hai α-giardin đều kích hoạt NLRP3 gây sốt.Kết quả của chúng tôi hơi khác so với kết quả của Manko-Prykhoda và cộng sự, người đã báo cáo rằng việc kích thích tế bào Caco-2 chỉ bằng các chủng G. muris hoặc E. coli EPEC có thể làm tăng cường độ huỳnh quang của NLRP3, ASC và caspase-1, mặc dù không đáng kể, trong khi việc mô phỏng chi phí của G. muris và E. coli đã làm tăng mức độ của ba loại protein như thế nào [49].Sự khác biệt này có thể là do sự khác biệt trong việc lựa chọn loài Giardia, dòng tế bào và tế bào sơ cấp.Chúng tôi cũng thực hiện các thử nghiệm in vivo bằng cách sử dụng MCC950 ở chuột cái WT C57BL/6 5 tuần tuổi, vốn dễ bị nhiễm G. tá tràng hơn.MCC950 là một chất ức chế NLRP3 phân tử nhỏ mạnh và có chọn lọc, ngăn chặn sự kích hoạt NLRP3 chính tắc và không chính tắc ở nồng độ nano.MCC950 ức chế kích hoạt NLRP3 nhưng không ảnh hưởng đến việc kích hoạt các đường dẫn viêm AIM2, NLRC4 và NLRP1 hoặc đường dẫn tín hiệu TLR [27].MCC950 chặn kích hoạt NLRP3 nhưng không ức chế sự khởi đầu NLRP3, dòng K+, dòng Ca2+ hoặc sự tương tác giữa NLRP3 và ASC;thay vào đó, nó ức chế sự kích hoạt hồng cầu NLRP3 bằng cách ngăn chặn quá trình oligome hóa ASC [27].Do đó, chúng tôi đã sử dụng MCC950 trong một nghiên cứu in vivo để xác định vai trò của dòng siêu nhỏ NLRP3 sau khi tiêm giardine.Caspase-1 p10 được kích hoạt sẽ tách các cytokine gây viêm pro-IL-1β và pro-IL-18 thành IL-1β và IL-18 trưởng thành [50].Trong nghiên cứu này, nồng độ IL-1β trong huyết thanh ở chuột được điều trị bằng giardine có hoặc không có MCC950 được sử dụng làm chỉ số cho biết liệu dòng siêu nhỏ NLRP3 có được kích hoạt hay không.Đúng như dự đoán, phương pháp điều trị MCC950 làm giảm đáng kể nồng độ IL-1β huyết thanh.Những dữ liệu này chứng minh rõ ràng rằng G. Duodenalis giardin alfa-2 và giardin alfa-7.3 có thể kích hoạt siêu vi khuẩn chuột NLRP3.
Dữ liệu quan trọng được tích lũy trong thập kỷ qua đã chứng minh rằng IL-17A là chất điều hòa miễn dịch chính chống lại G. muris, tạo ra tín hiệu IL-17RA, sản xuất peptide kháng khuẩn và điều chỉnh kích hoạt bổ thể [51].Tuy nhiên, nhiễm Giardia xảy ra thường xuyên hơn ở người trưởng thành trẻ tuổi và có báo cáo rằng nhiễm Giardia ở chuột non không kích hoạt phản ứng IL-17A để phát huy tác dụng bảo vệ của nó [52], khiến các nhà nghiên cứu phải tìm kiếm các loại Giardia điều hòa miễn dịch khác.cơ chế lây nhiễm giun sán.Các tác giả của một nghiên cứu gần đây đã báo cáo rằng G. muris có thể kích hoạt dòng hồng cầu NLRP3 bởi E. coli EPEC, giúp thúc đẩy sản xuất các peptide kháng khuẩn và làm giảm khả năng gắn kết của nó cũng như số lượng thể tư dưỡng trong đường ruột, do đó làm giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh đại tràng. bệnh do trực khuẩn gây ra [49].Dòng siêu nhỏ NLRP3 có liên quan đến sự phát triển của nhiều bệnh khác nhau.Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng Pseudomonas aeruginosa kích hoạt quá trình tự thực bào trong đại thực bào để tránh chết tế bào và quá trình này phụ thuộc vào sự kích hoạt của dòng hồng cầu NLRP3 [53].Đối với N. caninum, việc kích hoạt dòng siêu nhỏ NLRP3 qua trung gian các loại oxy phản ứng sẽ hạn chế sự nhân lên của nó trong vật chủ, khiến nó trở thành mục tiêu điều trị tiềm năng [9].Paracoccidioides brasiliensis đã được phát hiện là có tác dụng kích hoạt hồng cầu NLRP3 trong tế bào đuôi gai có nguồn gốc từ tủy xương chuột, dẫn đến giải phóng cytokine IL-1β gây viêm, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ vật chủ [10].Một số loài Leishmania, bao gồm L. amazonensis, L. Major, L. Braziliensis và L. infantum chagasi, kích hoạt NLRP3 và caspase-1 phụ thuộc ASC trong đại thực bào, cũng như nhiễm trùng Leishmania.Sự sao chép của ký sinh trùng được tăng cường ở những con chuột thiếu gen NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni và cộng sự.Nhiễm trùng Leishmania đã được báo cáo là gây ra sự kích hoạt dòng siêu nhỏ NLRP3 trong đại thực bào, làm hạn chế sự nhân lên của ký sinh trùng nội bào.Do đó, Leishmania có thể ức chế kích hoạt NLRP3 như một chiến lược tránh né.Trong các nghiên cứu in vivo, dòng siêu nhỏ NLRP3 đã góp phần loại bỏ Leishmania, nhưng không ảnh hưởng đến các mô [54].Ngược lại, trong các nghiên cứu về bệnh giun sán, việc kích hoạt dòng virus NLRP3 sẽ ức chế khả năng miễn dịch bảo vệ của vật chủ chống lại bệnh giun sán đường tiêu hóa [12].Shigella là một trong những vi khuẩn chính gây tiêu chảy trên toàn thế giới.Những vi khuẩn này có thể tạo ra IL-1β thông qua dòng K+ qua trung gian thụ thể P2X7, các loại oxy phản ứng, axit hóa lysosomal và tổn thương ty thể.Inflammasome NLRP3 điều chỉnh tiêu cực quá trình thực bào và hoạt động diệt khuẩn của đại thực bào chống lại Shigella [55].Các nghiên cứu về Plasmodium đã chỉ ra rằng những con chuột bị thiếu AIM2, NLRP3 hoặc caspase-1 bị nhiễm Plasmodium sản xuất ra lượng interferon loại 1 cao và có khả năng chống nhiễm Plasmodium cao hơn [56].Tuy nhiên, vai trò của alpha-2 giardine và alpha-7.3 giardine trong việc kích hoạt mầm bệnh gây viêm NLRP3 ở chuột vẫn chưa rõ ràng.
Trong nghiên cứu này, sự ức chế dòng hồng cầu NLRP3 của MCC950 đã làm giảm BW và tăng số lượng thể tư dưỡng trong dịch rửa ruột ở chuột, dẫn đến những thay đổi bệnh lý nghiêm trọng hơn ở mô tá tràng.Alpha-2 giardine và alpha-7.3 giardine kích hoạt hồng cầu NLRP3 của chuột chủ, tăng trọng lượng cơ thể chuột, giảm số lượng thể tư dưỡng trong dịch rửa ruột và làm giảm các tổn thương bệnh lý ở tá tràng.Những kết quả này cho thấy G. tá tràng có thể kích hoạt thể siêu vi của vật chủ NLRP3 thông qua alpha-2 giardine và alpha-7,3 giardine, làm giảm khả năng gây bệnh của G. tá tràng ở chuột.
Nói chung, các kết quả của chúng tôi chứng minh rằng giardines alpha-2 và alpha-7.3 gây ra sự kích hoạt các dòng siêu nhỏ của vật chủ NLRP3 và làm giảm khả năng lây nhiễm của G. tá tràng ở chuột.Vì vậy, những phân tử này là mục tiêu đầy hứa hẹn trong việc ngăn ngừa bệnh giardia.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Lương AKS, Lương AAM, Hoàng AHC, Sergi KM, Kam JKM.Bệnh Giardia: tổng quan.Gần đây có thông tin tiết lộ rằng Pat Inflamm bị dị ứng với thuốc.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Bệnh Giardia: đánh giá về liệu pháp dược lý.Ý kiến ​​chuyên gia của dược sĩ.2007;8: 1885–902.
Điền Hoa Phong, Trần Bân, Văn Kiếm Phong.Bệnh giardia, kháng thuốc và phát hiện ra các mục tiêu mới.Lây nhiễm các mục tiêu thuốc Disort.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, v.v. Các bệnh viêm nhiễm và viêm nhiễm NLRP3.Tế bào Oxide Med Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Vai trò của vi khuẩn gây viêm đường ruột và ung thư.Khoa tiêu hóa.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kích hoạt hồng cầu NLRP3 Canonical và không điển hình ở ngã tư của khả năng miễn dịch và viêm ruột.tiền miễn dịch.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.Kích hoạt hồng cầu NLRP3 qua trung gian ROS có liên quan đến phản ứng với nhiễm trùng N. caninum.Vectơ ký sinh trùng.2020;13:449.